□ 于學(xué)芹 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、山東醫(yī)藥技師學(xué)院中藥系 馬 曉 劉厚福 趙 麗 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院李文廣 云南省現(xiàn)代農(nóng)林投資有限公司 趙長峰 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

美藤果油和磷蝦油合劑對小鼠免疫功能的影響

□ 于學(xué)芹 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、山東醫(yī)藥技師學(xué)院中藥系 馬 曉 劉厚福 趙 麗 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院李文廣 云南省現(xiàn)代農(nóng)林投資有限公司 趙長峰 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

探討美藤果油和磷蝦油合劑對小鼠免疫功能的影響，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的美藤果油和磷蝦油合劑30 d，檢測其體重增長、脾臟和胸腺體重比值以及各項(xiàng)免疫功能指標(biāo)。結(jié)果表明，各組間小鼠體重增長差異無顯著性（P＞0.05），小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值差異亦無顯著性（P＞0.05），小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、NK細(xì)胞活性測定結(jié)果均為陽性，小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能測定結(jié)果為陰性。美藤果油和磷蝦油合劑具有增強(qiáng)小鼠免疫功能的作用。

美藤果油；磷蝦油；合劑；免疫功能；小鼠

美藤果（Plukenetia volubilis Linneo）又名南美油藤、星油藤、印加果等，是大戟科的一種木質(zhì)藤木植物，原生長在南美洲。2008年底我國引進(jìn)種源，2009年在云南省試驗(yàn)種植，現(xiàn)種植面積已達(dá)3 333余hm2。美藤果油來源于南美油藤種籽，富含不飽和脂肪酸，約占脂肪總含量的93%，其中必需脂肪酸亞油酸和α-亞麻酸分別占37%、47%，有調(diào)節(jié)血脂、預(yù)防心血管疾病、抗氧化等作用[1-2]。此外，美藤果油還含有生育酚、甾醇、多酚等活性物質(zhì)。2013年1月，我國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會將其列為新資源食品[3]。

磷蝦屬于無脊椎動物，是磷蝦科動物的通稱。南極磷蝦蘊(yùn)藏量豐富，是地球上數(shù)量最大的單種生物資源之一。磷蝦油是從磷蝦中提取的，含有磷脂、ω-3脂肪酸、蝦青素等多種生物活性成分，具有抑制肝脂肪化、降血脂、降血糖、預(yù)防心血管疾病等功能[4-7]。此外，磷蝦油含有大量的ω-3長鏈多不飽和脂肪酸，其中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸可能與免疫功能有關(guān)[8]。由于美藤果油和磷蝦油原料豐富，營養(yǎng)價值高，近年來關(guān)于其活性研究較多，但對其免疫作用研究較少，更未見對兩者混合物進(jìn)行研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要研究美藤果油和磷蝦油合劑能否增強(qiáng)小鼠的免疫功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用健康SPF昆明種小鼠，體重18～22 g，由山東大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠20只，雌雄各半。免疫功能檢測實(shí)驗(yàn)雌性小鼠200只，分為4個免疫大組，每免疫大組又分為水對照組、溶劑對照組、低、中、高劑量組，各10只。免疫1組用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）實(shí)驗(yàn)、血清溶血素測定、抗體生成細(xì)胞數(shù)測定；免疫2組用于小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)；免疫3組用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；免疫4組用于小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和小鼠NK細(xì)胞活性測定。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%。

1.1.2 受試物及劑量選擇

美藤果油和磷蝦油合劑（67%美藤果油，33%磷蝦油）為紅色油狀液體，由云南省現(xiàn)代農(nóng)林投資有限公司提供。人體推薦量為每人每日3.0 g/60 kg.bw，按相當(dāng)于其5、10、30倍確定小鼠的低、中、高劑量，即各組小鼠每日劑量分別為0.25 g/kg.bw、0.50 g/ kg.bw、1.50g/kg.bw，經(jīng)口每日一次灌胃，灌胃體積按10 mL/kg.bw。灌胃前用玉米油配制受試物，低、中、高劑量組受試物的濃度分別為25 g/L、50 g/L和150 g/L，水對照組以等體積的蒸餾水代替受試物，溶劑對照組連續(xù)給予等體積的玉米油，30 d后測各項(xiàng)免疫指標(biāo)。小鼠以遠(yuǎn)交系小鼠專用飼料喂飼。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

紫外分光光度計(jì)、酶聯(lián)免疫檢測儀、光學(xué)顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、24孔和96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受量（MTD）試驗(yàn)。小鼠空腹16 h后，將合劑原液灌胃1次，容量為0.22 mL/10g.bw，即劑量為20.46 g/kg.bw，連續(xù)觀察14 d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.2.2 臟器體重比值測定

小鼠稱重后頸椎脫臼處死，取其胸腺、脾臟，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污并稱重，計(jì)算胸腺體重比值與脾臟體重比值。

1.2.3 免疫功能檢測

細(xì)胞免疫功能檢測采用遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（足跖增厚法，DTH）和ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）；體液免疫功能檢測采用抗體生成細(xì)胞測定（Jerne改良玻片法）和血清溶血素的測定；單核-巨噬細(xì)胞功能檢測采用小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）；NK細(xì)胞活性測定采用乳酸脫氫酶LDH測定法。

1.2.4 結(jié)果判定依據(jù)

根據(jù)原衛(wèi)生部頒發(fā)的《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）》中關(guān)于急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)和增強(qiáng)免疫力功能判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

兩種性別的小鼠均未見明顯的中毒癥狀，也無死亡。將受試小鼠處死后進(jìn)行解剖檢查，肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、胃和腸等主要器官，均未見明顯異常改變。受試樣品對兩種性別小鼠的MTD均大于20.46 g/kg.bw，判定合劑屬無毒級。

2.2 不同組間小鼠體重、臟器體重比值比較

小鼠初始體重均數(shù)在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.211，P=0.931），說明體重分布較為均衡。灌胃30 d后，體重增長值均數(shù)在各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.362，P=0.834）。小鼠脾臟體重比值均數(shù)（F=0.204，P=0.935）和胸腺體重比值均數(shù)（F=0.598，P=0.666）在各組間比較，差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

2.3 各劑量組小鼠細(xì)胞免疫功能指標(biāo)比較

小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)結(jié)果顯示，小鼠足跖腫脹度均數(shù)在各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.343，P=0.005)，見表2。LSD兩兩比較法結(jié)果顯示，足跖腫脹度均數(shù)在低劑量組與水對照組（P=0.747）、低劑量組與溶劑對照組（P=0.916）間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在中劑量組與水對照組（P=0.009）、高劑量組與水對照組（P=0.003）、中劑量組與溶劑對照組（P=0.026）、高劑量組與溶劑對照組間（P=0.011）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即中、高劑量組遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力均高于對照組。

ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間的淋巴細(xì)胞增殖能力均數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.464，P=0.762），見表2。

2.4 各劑量組小鼠體液免疫功能指標(biāo)比較

小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)測定表明各組間抗體生成細(xì)胞數(shù)均數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.205，P=0.934），見表2。

小鼠血清溶血素實(shí)驗(yàn)中，各組間抗體積數(shù)均數(shù)在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.790，P=0.003）。LSD兩兩比較法結(jié)果顯示，低劑量組與水對照組、低劑量組與溶劑對照組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組與水對照組、高劑量組與水對照組、中劑量組與溶劑對照組、高劑量組與溶劑對照組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即中、高劑量組小鼠抗體產(chǎn)生的量高于對照組，見表2。

表1 不同組間小鼠臟器體重比值比較（n=10）

2.5 不同劑量組小鼠非特異性免疫功能指標(biāo)比較

2.5.1 小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能影響

采用小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清能力測定實(shí)驗(yàn)和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力測定實(shí)驗(yàn)。前者吞噬指數(shù)1均數(shù)在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.371，P=0.828）。后者吞噬率不符合方差分析條件，進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析；結(jié)果顯示吞噬率平方根反正弦轉(zhuǎn)換值（F=0.486，P=0.746）和吞噬指數(shù)2（F=0.070，P=0.991）在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.5.2 小鼠NK細(xì)胞活性改變

小鼠NK細(xì)胞活性百分率不符合方差分析條件，將百分率進(jìn)行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析。灌胃合劑后，小鼠NK細(xì)胞活性率平方根反正弦轉(zhuǎn)換值均數(shù)在各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.380，P=0.001)。LSD兩兩比較法結(jié)果顯示，低劑量組與水對照組、中劑量組與水對照組、低劑量組與溶劑對照組、中劑量組與溶劑對照組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即低、中劑量組小鼠NK細(xì)胞活性高于對照組；高劑量組與水對照組（P=0.087）、高劑量組與溶劑對照組（P=0.061）間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

3 討論

T細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫是反映機(jī)體免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)的重要參數(shù)，單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能、NK細(xì)胞活性可衡量機(jī)體非特異性免疫功能。美藤果油和磷蝦油合劑可增加小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力和小鼠血清溶血素水平（兩者均有兩個劑量為陽性），即增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞和體液免疫功能，同時還能增加小鼠NK細(xì)胞活性，因此，可認(rèn)為美藤果油和磷蝦油合劑可增強(qiáng)小鼠的免疫功能。此結(jié)果可能與n-3多不飽和脂肪酸有關(guān)[8-9]，還可能與蝦青素提高免疫力作用有關(guān)[10]。

DTH是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，它無需抗體或補(bǔ)體參加，在變應(yīng)原的作用下形成致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次接觸相同變應(yīng)原時，可表現(xiàn)出一種遲緩（至少約12 h后才出現(xiàn)反應(yīng)，24～72 h達(dá)高峰）以細(xì)胞變性壞死為特征的局部變態(tài)反應(yīng)性炎癥，具體到本研究采用的是足趾增厚法，以攻擊前后足趾厚度之差值（足趾腫脹度）表示DTH的程度，反映細(xì)胞免疫功能。DTH實(shí)驗(yàn)和血清溶血素實(shí)驗(yàn)，兩者均是中劑量組和高劑量組與對照組差異有顯著性意義，可能由于美藤果油和磷蝦油合劑劑量和小鼠免疫功能之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系，需要達(dá)到一定的量才能發(fā)揮出作用。NK細(xì)胞是一類非特異性免疫細(xì)胞，它無需提前接觸抗原即可殺傷靶細(xì)胞，且其殺傷效應(yīng)無主要組織相容性復(fù)合體限制性，不依賴抗體；它是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素，也參與第Ⅱ型超敏反應(yīng)，還能分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫、造血和直接殺傷靶細(xì)胞的作用。NK細(xì)胞活性增強(qiáng)說明非特異性免疫功能有一定改善。美藤果油和磷蝦油合劑低劑量組、中劑量組活性明顯高于對照組，而高劑量與對照組差異無顯著性，原因可能是磷蝦油蛋白肽中的重金屬元素（如氟、銅）對小鼠的毒性作用[5]，可進(jìn)一步研究磷蝦油蛋白脫脂肽的毒性和食用安全性。

美藤果油和磷蝦油合劑對小鼠的脾臟體重比值和胸腺體重比值無影響，與徐愷[5]，周大勇[11]等研究結(jié)果不一致，可能因?yàn)楸狙芯康氖敲捞俟秃土孜r油合劑，而后者則只研究磷蝦油，也有可能跟劑量有關(guān)。美藤果油和磷蝦油合劑對小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能亦無影響，與周大勇[11]等研究結(jié)果不一致，可能由劑量不同所致。

綜上所述，美藤果油和磷蝦油合劑對小鼠免疫功能具有增強(qiáng)作用。食用油在人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉?，近年來我國食用植物油供需形勢?yán)峻，自給率只有40%左右，約60%食用植物油依賴進(jìn)口[12-13]。美藤果種植周期短，美藤果油和磷蝦油資源豐富，作為新資源食品，兩者的共同特點(diǎn)是富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，不僅營養(yǎng)價值高，且具有多種生物活性。本研究發(fā)現(xiàn)兩者混合使用可增強(qiáng)小鼠免疫功能，因此，預(yù)測美藤果油和磷蝦油合劑將來會有較好的食用價值和市場前景。

表2 各劑量組小鼠細(xì)胞和體液免疫功能指標(biāo)比較（n=10）

表3 不同劑量組小鼠非特異性免疫功能指標(biāo)比較（n=10）

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