劉志海 范紅梅 金 昭 隆 林 余 蘭

黔西南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 興義 562400

興仁金線蓮中槲皮素、異鼠李素的薄層鑒別及不同部位的含量測(cè)定

劉志海 范紅梅 金 昭 隆 林 余 蘭

黔西南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 興義 562400

目的:建立興仁金線蓮的槲皮素、異鼠李素薄層鑒別及不同部位的含量測(cè)定方法。方法:采用薄層色譜法，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑，用槲皮素、異鼠李素為對(duì)照品，建立其薄層鑒別方法；采用高效液相色譜法，Gemini-NX 5u C18 110A(250mm×4.6mm)色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相，在波長(zhǎng)370nm處測(cè)定興仁金線蓮不同部位中的含量。結(jié)果：建立了興仁金線蓮TLC法，測(cè)定了興仁金線蓮不同部位槲皮素、異鼠李素含量，該兩種成分主要富集中葉中，莖、根含量較微。結(jié)論：該薄層色譜法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，可用于興仁金線蓮的鑒別，含量測(cè)定方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定,可用于測(cè)定興仁金線蓮不同部位中的含量。

興仁金線蓮；薄層鑒別；槲皮素；異鼠李素；含量測(cè)定

興仁金線蓮(AnoectochilusxingrensisZ.H.Tsi et X.H.Jin)為蘭科多年生草本植物的全草，2002年吉占和、金效華等在貴州興仁等地發(fā)現(xiàn)并命名的新種[1]。該植物臨床用于冶療高血壓、高血脂、糖尿病、腫瘤、肺結(jié)核咳血、重癥肌無力肝炎、腎炎、小兒急驚風(fēng)、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女白帶以及毒蛇蛟傷等癥。民間素有“藥王”、“金草”、“神草”、“烏人參”等美稱，是極其稀少的瀕危藥用植物[2]。目前野生興仁金線蓮資源日益匱乏，金線蓮品種又較為復(fù)雜，同時(shí)金線蓮作用民間習(xí)用藥，價(jià)格昂貴，但由于金線蓮尚未收入《中國(guó)藥典》，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，急切需要科學(xué)的鑒別及定量方法對(duì)質(zhì)量進(jìn)行控制。因此本文應(yīng)用TCL法，以槲皮素、異鼠李素為對(duì)照品，建立了其薄層鑒別方法，為興仁金線蓮的資源開發(fā)及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考；采用高效液相色譜法，測(cè)定了興仁金線蓮不同部位槲皮素、異鼠李素含量，葉中含量最高，莖、根中較低，以期為興仁金線蓮藥材質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀，Empower色譜數(shù)據(jù)工作站；日本島津AUY220電子天平(萬分子一)；賽多利斯CPA2250電子天平(十萬分子一)；電熱恒溫干燥箱(上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公式醫(yī)療設(shè)備)；預(yù)制硅膠G薄層板(青島海洋化工廠分廠)；ZF-2三用紫外儀(上海安亭儀器有限公司)。

1.2 材料 槲皮素(批號(hào)：10081-200907，含量為96.5%)、異鼠李素(批號(hào)：110860-201109，含量為99.0%)購自中國(guó)食品藥品研究院；興仁金線(Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin)、福建金線(Anoectochilus roxburghii)、臺(tái)灣金線蓮(Anoectochilus formosanus Hay)由興義師范學(xué)院周麗教授提供，中科院昆明植物研究所彭華研究員鑒定。乙腈(色譜純，德國(guó)默克，批號(hào)：1728130408)、水(娃哈哈，批號(hào)：1122QG)，鹽酸(西隴化工股份有限公司，批號(hào)：150426)、磷酸(成都金山化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120130)、乙醇(天津市福展化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20141120)、甲醇(西隴化工股份有限公司，批號(hào)：150402)、甲苯(國(guó)營(yíng)重慶無機(jī)化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20040301)、甲酸乙酯(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：20030102)、甲酸(西隴化工股份有限公司，批號(hào)：1405132)均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 供試品的制備 取本品粉末1g，加80%甲醇50mL，加熱回流1h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次20mL，棄去乙醚液，水液加鹽酸5mL，加熱回流1h，取出，立即冷卻，用乙醚振搖提取2次,每次20mL，合并乙醚液，用水10mL洗滌，棄去水液，乙醚液用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液揮干，殘?jiān)右掖糽ml使溶解，作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取槲皮素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品，加乙醇制成每lmL各含 0.5mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。2.3 薄層色譜條件及薄層鑒別 將供試品及對(duì)照品溶液各10μL點(diǎn)于同一硅膠G板(已活化30min)，置雙槽展開缸中，飽和10min，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑，展開(展距約8cm)，取出，晾干，噴以3 %三氯化鋁乙醇溶液，在 105°C 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈( 365nm) 下檢視，薄層色譜圖見圖1。

3 不同部位槲皮素、異鼠李素含量測(cè)定

3.1 色譜條件 Gemini-NX 5u C18 110A(250mm×4.6mm)色譜柱，以乙腈-0.4%磷酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相， 柱溫：30℃；流速：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL; 檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm。

3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL各含槲皮素12.18μg、異鼠李素10.62μg的混合對(duì)照溶液，對(duì)照品色譜圖見圖2。

3.3 供試品溶液的制備 取興仁金線蓮藥材不同部位粉末2g，精密稱定，精密加入5%鹽酸乙醇溶液50mL，稱定重量，水浴加熱回流2h，取出，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得，所得色譜圖見圖3。

3.4 線性關(guān)系的考察 分別取上述槲皮素、異鼠李素對(duì)照品混合溶液2、5、10、20、25μL注入液相色譜儀，按3.1項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y),計(jì)算回歸方程，槲皮素為Y=37346X+2147，R=0.9999,異鼠李素為為Y=773056X+5446,R=0.9998，結(jié)果表明：槲皮素在2.436～30.45μg、異鼠李素在2.124～26.55μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“3.1”項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，計(jì)算槲皮素RSD值為0.4%；異鼠李素RSD值0.3%。3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批興仁金線蓮粉末6份，按3.3操作，制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，計(jì)算其含量，結(jié)果槲皮素RSD值為1.7%，異鼠李素RSD值1.4%。

3.7 穩(wěn)定性考察 取同一批興仁金線蓮供試品溶液，在0、2、4、8、12h，按“3.1”項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，計(jì)算槲皮素峰面積RSD值為1.3%，異鼠李素峰面積RSD值為1.8%。

3.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(批號(hào)：2013080905)興仁金線蓮藥材6份，每份約1g，加入同等量的槲皮素、異鼠李素對(duì)照品，按“3.2”供試品的制備方法制備，“3.1”項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，計(jì)算回收率，槲皮素平均加樣回收率為93.2%，異鼠李素平均加樣回收率為95.3%。3.9 樣品水分的測(cè)定 精密稱定樣品(不同部位)2g，置稱量瓶中，打開瓶蓋在105℃干燥5h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，再在上述溫度干燥1h，冷卻，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量(%)，結(jié)果見表1。

3.10 樣品的測(cè)定 分別精密稱取3批次的興仁金線蓮藥材(不同部位，9批次)、1批臺(tái)灣金線蓮、1批福建金線蓮，按“2.2”供試品的制備方法制備，“3.1”項(xiàng)下進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，計(jì)算槲皮素、異鼠李素含量(見表1)。

表1 樣品不同部位含量測(cè)定表

4 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了興仁金線蓮薄層色譜鑒別，根據(jù)槲皮素、異鼠李素的化學(xué)性質(zhì)，選擇了預(yù)制硅膠G板、GF254板、及聚酰胺薄膜為展開載體，展開劑參考資料[3-4]選擇乙醇-水(7∶3)、甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸(7∶5∶0.8)，提取方法參考了《中國(guó)藥典》2015年版羅布麻葉[鑒別](3)，經(jīng)多次試驗(yàn)，最終選擇硅膠G板為載體、甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑、藥典的水解萃取法為提取方法，該法提取簡(jiǎn)便、分離效果好、專屬性強(qiáng)，該試驗(yàn)同時(shí)還收集了福建金線蓮及臺(tái)灣金線蓮進(jìn)行薄層比較實(shí)驗(yàn)，無顯著差異，該薄層鑒別方法適用于其它金線蓮品種。研究還參考文獻(xiàn)[5]測(cè)定了興仁金線蓮不同部位的槲皮素、異鼠李素的含量，從表1可以看出不同部位的槲皮素、異鼠李素含量有顯著差異，兩種成分主要富集中葉中，莖、根中含量較微。

[1]金效華，吉占和，覃海寧，等. 貴州蘭科植物增補(bǔ)[J].植物分類學(xué)報(bào)，2002，40(1)：82-88.

[2] 隆林，范紅梅，周麗.興仁金線蓮的HPLC指紋圖譜研究[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2016，(4) ：40-44.

[3] 劉亮，馮華，劉英波，等.黔產(chǎn)辣蓼中槲皮素的薄層鑒別與含量測(cè)定[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43(10) ：191-194.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：211.

[5] 隆林.高效液相色譜法測(cè)定興仁金線蓮中黃酮的含量[J]. 醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，(2): 86-87.

(編輯：梁志慶)

TLC Identification of Quercetin and Isorhamnetin of Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin and Content Determination in Different Parts

LIU Zhihai FAN Hongmei JIN Zhao LONG Lin YU Lan

Qianxinan Food and Drug Testing Center, Xiyi 562400,China

Object To establish the TLC identification method of quercetin and isorhamnetin in Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin and determined the content in different parts.Methods The TLC identification method is established by using toluene-ethhyl formate-formic acid (10∶8∶1) and taking quercetin and isorhamnetin as CK. The contents of quercetin and isorhamnetin in different parts of Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin were determined by HPLC under the conditions including chromatographic column of Gemini-NX 5u C18 110A (250mm×4.6mm)，moving phase of acetonitrile-0.2% phosphate, and the detection wavelength at 370nm.Result The TLC identification method of Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin is established. It is determined that the contents of quercetin and isorhamnetin in different parts of Anoectochilus xingrensis Z.H.Tsi et X.H.Jin. The results shows the two components accumulated mainly in leaves, but little in stems and roots.Conclusion The method of TLC is convenient and highly specific, which could be used for identification Anoectochilus xingrensis. The content determination method is sensitive, accurate and stale, which could be used for the content determination in different parts of Anoectochilus xingrensis.

AnoectochilusxingrensisZ.H.Tsi et X.H.Jin; Thin Layer Chromatography; Quercetin; Isorhamnetin; Content Determination

2016-10-12

劉志海(1982-)，男，本科，主管中藥師，主要從事中藥、中成藥檢檢測(cè)工作，同時(shí)從事中藥、中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail:19889504@qq.com

R719

A

1007-8517(2016)24-0025-03