蔣樹新，劉華良，馬永建*,阮麗萍

(1.東南大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009)

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在線固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)飲料中5種食用合成色素

蔣樹新1,2，劉華良1,2，馬永建1,2*,阮麗萍2

(1.東南大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009)

建立了同時(shí)測(cè)定飲料中5種食用合成色素的在線固相萃取-高效液相色譜-紫外檢測(cè)(Online-SPE-HPLC-UV)方法。飲料樣品用水稀釋并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，在線固相萃取柱(Acclaim 120 C18)凈化，反相 C18分析柱分離，梯度洗脫，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明：5種食用合成色素在0.5～20 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 9，檢出限為0.02～0.08 mg/kg，3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率為94.5%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～2.7%。該研究為快速準(zhǔn)確地分離測(cè)定飲料中的食用合成色素提供了有效方法。

在線固相萃取；食用合成色素；飲料；高效液相色譜

合成色素，又稱合成著色劑，是指用人工化學(xué)合成的方法制得的有機(jī)化合物，主要以煤焦油中提煉出的苯胺染料為原料制得。與天然色素相比，合成色素具有色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)[1]，在食品加工過程中常被用來改善食品的感官性質(zhì)[2]。大量研究表明，過量的合成色素及其分解產(chǎn)物會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害，包括急性中毒、慢性中毒、致突變性、致畸性、致敏性以及胚胎毒性等，甚至致癌[3]。

已有不少研究建立了合成色素的檢測(cè)方法。目前合成色素的提取方法大多為離線提取，比如液液萃取法(LLE)[4-5]、固相萃取法(SPE)[6-9]、QuECHERs法[10]、聚酰胺吸附法[11]，以及近年發(fā)展起來的磁分散固相萃取(M-dSPE)[12]和加速溶劑萃取(ASE)[13]等。但這些方法大多樣品前處理過程復(fù)雜，需耗費(fèi)大量時(shí)間、人力物力和有機(jī)溶劑。本研究首次建立了飲料中5種食用合成色素的在線分析方法，樣品經(jīng)稀釋過濾后直接上樣，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，且簡(jiǎn)化了分析步驟，減少了有機(jī)溶劑的使用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

雙三元液相色譜系統(tǒng)(美國(guó) Thermo Fisher 公司)，配備DGP-3600RS泵、WPS-3000自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3X00(RS)柱溫箱(配1個(gè)六通閥)、VWD-3X00(RS)檢測(cè)器；Chromeleon 7.0變色龍色譜管理軟件；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)；渦旋混合器(美國(guó) Scientific Industries公司)；分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超聲波清洗器(德國(guó)Elma 公司)。

甲醇(色譜純，德國(guó)默克股份兩合公司)；乙酸銨(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)中心，濃度均為0.5 mg/mL；誘惑紅(80%)購(gòu)自Laboratories of Dr.Ehrenstorfer(德國(guó))。

1.2 樣品處理

稱取飲料樣品5.0 g(含二氧化碳樣品需超聲振蕩去除二氧化碳，精確至0.01 g)，用水稀釋定容至10 mL，混勻過0.45 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3 在線固相萃取和色譜分離條件

在線萃取柱為Acclaim 120 C18柱(10 mm×4.6 mm，5 μm)，分析色譜柱為Agilent Extend-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣量為10 μL,柱溫25 ℃；右泵(online-SPE pump)為凈化泵，采用0.2%甲酸溶液(溶劑A)和甲醇(溶劑B)梯度洗脫；左泵(Analytical pump)為分析泵，采用0.02 mol/L乙酸銨溶液(溶劑A)和甲醇(溶劑B)梯度洗脫。分別于5.8 min和16 min處切換六通閥。六通閥切換程序及分析流路梯度洗脫程序見表1，具體切換通路見圖1～2。

表1 在線凈化與色譜分離的梯度洗脫條件

圖1 萃取階段及清洗平衡階段的閥切換通路Fig.1 Column switching mechanism in extraction and cleaning periods

圖2 轉(zhuǎn)移階段及分離階段閥的切換通路Fig.2 Column switching mechanism in transfer and analytical periods

2 結(jié)果與討論

2.1 在線固相萃取條件優(yōu)化

2.1.1 在線萃取柱的選擇 比較了TurboFlow MAX，SolEx RSLC HRP，Oasis WAX，Acclaim 120 C184種萃取柱的凈化效果。結(jié)果表明：TurboFlow MAX柱是混合型強(qiáng)陰離子反相吸附柱，該類型萃取柱對(duì)合成色素的保留能力較強(qiáng)，采用各種體積比的甲醇-0.5%甲酸溶液、乙腈-0.5%甲酸溶液、甲醇-0.05 mol/L乙酸銨、乙腈-0.05 mol/L乙酸銨等一系列高有機(jī)相、高濃度緩沖鹽、低pH值的洗脫溶液均不能將合成色素洗脫下來；SolEx RSLC HRP的填料鍵合了親水性膜的二乙烯苯聚合物，5種合成色素均在死時(shí)間處被直接洗脫；Oasis WAX柱為混合型弱陰離子反相吸附柱，對(duì)酸性化合物具有高的選擇性和靈敏度，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，須用氨水比例達(dá)2%以上的氨水-甲醇溶液才能將5種合成色素全部洗脫，而此時(shí)洗脫溶液會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的分析過程造成嚴(yán)重干擾，無(wú)法準(zhǔn)確定量。Acclaim 120 C18柱具有極高的表面覆蓋率和極低的金屬含量，通過優(yōu)化上樣和凈化條件可去除大量雜質(zhì)，有效保留5種合成色素。因此，本研究選擇Acclaim 120 C18柱作為最佳在線萃取柱。

2.1.2 萃取流動(dòng)相的選擇 萃取流動(dòng)相的選擇對(duì)在線萃取效率有著顯著影響。采用甲醇-純水(10∶90)、純水作為上樣溶液，無(wú)法保留莧菜紅；通過調(diào)節(jié)上樣溶液pH值，采用甲醇-0.2%甲酸溶液(10∶90)可有效保留5種合成色素。在凈化條件優(yōu)化過程中，比較了不同體積比的甲醇-0.2%甲酸溶液的凈化效果，結(jié)果表明：以甲醇-0.2%甲酸溶液(10∶90)作為凈化溶劑時(shí)，可有效分離目標(biāo)化合物和雜質(zhì)，保留時(shí)間在0～5.8 min范圍內(nèi)的雜質(zhì)基本清除完畢，目標(biāo)化合物于6 min開始流出，所以確定第一次閥切換時(shí)間為5.8 min。

2.2 分離條件的優(yōu)化

本研究表明當(dāng)洗脫溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)才能有效洗脫這5種合成色素，而且5種化合物在C18分析柱上的保留能力相差較大，莧菜紅的保留能力較弱，用低比例有機(jī)相流動(dòng)相洗脫時(shí)能被洗脫。若采用一般方法以60%甲醇的洗脫溶液集中洗脫后再進(jìn)行梯度洗脫，莧菜紅和胭脂紅將無(wú)法分離并很快從分析柱流出。因此，本研究將洗脫與分析步驟合并，即在凈化過程完成后，通過閥切換串聯(lián)在線萃取柱與分析柱，將目標(biāo)化合物洗脫到分析柱上進(jìn)行分離，直至最后1種目標(biāo)化合物(亮藍(lán))分離完畢(15.3 min)后，于16 min處再次切換六通閥，進(jìn)行在線萃取柱的清洗平衡，以備下次進(jìn)樣。

本文還考察了柱溫(20～35 ℃)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明：柱溫對(duì)被測(cè)化合物的分離度影響不大，而各被測(cè)化合物的保留值隨柱溫升高有所提前；當(dāng)柱溫達(dá)到30 ℃及以上時(shí)，日落黃的響應(yīng)值顯著下降。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇25 ℃為最佳檢測(cè)柱溫。

本研究對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化。國(guó)標(biāo)(GB/T5009.35-2003)[14]采用254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定不同種類的合成色素，該波長(zhǎng)下干擾物質(zhì)多，靈敏度不高，特異性不強(qiáng)。本研究利用二極管陣列檢測(cè)器掃描獲得不同合成色素的紫外-可見吸收光譜，各組分的最大吸收波長(zhǎng)為：莧菜紅(520 nm)、胭脂紅(510 nm)、日落黃(486 nm)、誘惑紅(510 nm)、亮藍(lán)(630 nm)。以目標(biāo)化合物的最大吸收波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)，可提高靈敏度，減少雜質(zhì)干擾，同時(shí)獲得良好峰形。在已優(yōu)化的萃取、分離和檢測(cè)條件下，分別對(duì)合成色素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品和空白樣品進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見圖3。

圖3 5種合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(10 μg/mL，A)、樣品中日落黃(486 nm,B)及空白樣品(C)的色譜圖

2.3 方法的線性范圍與定量下限

用水配制系列濃度5種合成色素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析。以5種合成色素的峰面積(y)與其濃度(x,mg/L)進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。結(jié)果表明，5種合成色素在0.5～20 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2大于0.999 9。在空白樣品中添加一系列低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算檢出限，根據(jù)10倍信噪比計(jì)算定量下限，得檢出限為0.02～0.08 mg/kg，定量下限為0.08～0.44 mg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 5種合成色素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

2.4 方法的回收率與精密度

稱取適量空白飲料樣品進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(中水平加標(biāo)量為GB 2760-2014[15]規(guī)定的最大限量值)，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。測(cè)得回收率為94.5%～103.0%，RSD為0.4%～2.7%(見表3)。方法顯示了良好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足實(shí)際樣品的分析要求。

表3 回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從南京市鼓樓區(qū)的超市購(gòu)買飲料樣品共6份，采用本方法進(jìn)行分析檢測(cè)。樣品1中檢出莧菜紅2.92 mg/kg，亮藍(lán)0.30 mg/kg；樣品2中檢出亮藍(lán)0.54 mg/kg；樣品3中檢出誘惑紅0.49 mg/kg；樣品4中檢出莧菜紅0.76 mg/kg，胭脂紅1.55 mg/kg；樣品5中檢出亮藍(lán)0.40 mg/kg；樣品6中檢出胭脂紅0.49 mg/kg，日落黃17.06 mg/kg。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，6份樣品的色素含量均未超出GB 2760-2014規(guī)定的限量要求。

3 結(jié) 論

本文建立了在線固相萃取-高效液相色譜檢測(cè)飲料中5種合成色素的分析方法。飲料樣品經(jīng)稀釋過濾后可直接上樣，無(wú)需其他前處理步驟。通過優(yōu)化在線萃取條件和分離條件，可以實(shí)現(xiàn)5種合成色素的有效分離，并且可以獲得較為理想的準(zhǔn)確度和精密度。本方法具有操作簡(jiǎn)單、快速簡(jiǎn)便、省時(shí)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足飲料中合成色素的定量分析要求，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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Determination of 5 Edible Synthetic Pigments in Drinks by Online Solid-phase Extraction Coupled with High Performance Liquid Chromatography

JIANG Shu-xin1,2，LIU Hua-liang1,2，MA Yong-jian1,2*，RUAN Li-ping2

(1.School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China；2.Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanjing 210009，China)

A method was developed for the determination of 5 kinds of synthetic pigments in drinks by online solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-ultraviolet detection(online-SPE-HPLC-UV).The drinks samples were diluted with water，and filtered with 0.45 μm microporous membrane filter.Then the samples were purified on an Acclaim 120 C18column and separated on a reversed-phase column by gradient elution.The detection was performed by ultraviolet detection.The calibration curves of 5 kinds of synthetic pigments were linear in the concentration range of 0.5-20 mg/L，with correlation coefficients(r2) greater than 0.999 9.The limits of detection(LODs) were in the range of 0.02-0.08 mg/kg.The recoveries of 5 kinds of synthetic pigments at three spiked levels ranged from 94.5% to 103.0%，with relative standard deviations of 0.4%-2.7%.The research provides an effective method for the rapide determination of edible synthetic pigments in drinks.

online solid-phase extraction;edible synthetic pigments;drinks;high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-03-10；

2016-07-10

江蘇省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(BE2010745)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.011

O657.72;TS264.4

A

1004-4957(2016)12-1581-05

*通訊作者：馬永建，碩士，主任技師，研究方向：分析化學(xué)，Tel：025-83759366，E-mail：mayongjian@jscdc.cn