余宇成，方 靈，蘇德森*，林 虬，傅建煒，羅 超

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)藥質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所 福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建福州 350001；2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350005)

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氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定烏龍茶中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥

余宇成1，方 靈1，蘇德森1*，林 虬1，傅建煒1，羅 超2

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)藥質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所 福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測試重點實驗室，福建福州 350001；2.福建省食品藥品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350005)

建立了烏龍茶中5種氨基甲酸酯農(nóng)藥(速滅威、異丙威、仲丁威、殘殺威和抗蚜威)同時測定的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)分析方法。樣品經(jīng)正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液提取后，通過400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4的QuEChERS試劑盒進行凈化，Rxi-5 Sil MS毛細管柱(30 m，0.25 mm×0.25 μm)進行分離，串聯(lián)質(zhì)譜進行定性定量分析。5種農(nóng)藥在各自的線性范圍(速滅威和殘殺威為5～500 μg/kg，異丙威、仲丁威和抗蚜威為1～500 μg/kg)內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99；在5，20，100 μg/kg 3個加標水平下，速滅威和殘殺威的平均回收率為77.5%～95.4%，相對標準偏差(RSD，n=6)為2.1%～6.1%，檢出限和定量下限分別為1 μg/kg和5 μg/kg；在1，20，100 μg/kg 3個加標水平下，異丙威、仲丁威和抗蚜威的平均回收率為79.5%～102.5%，RSD為2.0%～8.2%，檢出限和定量下限分別為0.2 μg/kg和1 μg/kg。該方法操作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可滿足烏龍茶樣品中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的分析要求。

烏龍茶；QuEChERS；氨基甲酸酯農(nóng)藥；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

氨基甲酸酯農(nóng)藥是一類廣譜殺蟲劑，是以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來的，由于其具有藥效快、殺蟲譜廣、易代謝、高效、選擇性強等優(yōu)勢[1]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中得到廣泛使用。但氨基甲酸酯類農(nóng)藥屬于膽堿酯酶抑制劑，可以抑制人體內(nèi)的乙酰堿酯酶，使體內(nèi)的酶活性下降而引起中毒，如滅多威可引起頭昏、頭痛和視力模糊等不良反應(yīng)，嚴重時危害神經(jīng)系統(tǒng)；涕滅威亞砜和涕滅威砜可能對小牛胸腺DNA造成加合作用[2-5],對人體健康造成嚴重危害，同時，該農(nóng)藥殘留對環(huán)境也產(chǎn)生越來越大的影響。因此，世界各國及組織先后制定了多種氨基甲酸醋類農(nóng)藥的最高殘留限量(MRL)[6-9]，限量標準日益嚴格。烏龍茶作為我國產(chǎn)量較大的茶葉品種之一，其在種植過程中農(nóng)藥濫用導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為影響我國烏龍茶出口的重要原因之一，形成的貿(mào)易壁壘嚴重阻礙了我國烏龍茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因而控制茶葉農(nóng)藥殘留量，保證其品質(zhì)顯得越來越重要。

目前，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析主要采用氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-15]。但氣相色譜法對于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度較低；液相色譜法檢測氨基甲酸酯類農(nóng)藥時，需進行衍生，操作復(fù)雜，衍生試劑昂貴，易發(fā)生衍生不完全的現(xiàn)象；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測成本相對較高，且操作較為繁瑣。因此，探索一種前處理簡便、靈敏度高的檢測方法迫在眉睫。本研究選取福建特色茶種烏龍茶作為研究對象，考察了仲丁威、異丙威、抗蚜威、速滅威、殘殺威5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留特性，建立了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測烏龍茶中5種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Shimadzu GC-MS TQ8040氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)；渦旋振蕩器(德國IKA公司)；HGC-36A氮吹儀(天津恒奧有限公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Anke TDL-5-A離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；AL 204電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

色譜純的丙酮、正己烷、乙酸乙酯，QuEChERS試劑盒(400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4)均購自中國Dikma公司；仲丁威、異丙威、抗蚜威、速滅威、殘殺威5種標準物質(zhì)均購自Dr.Ehrenstorfer公司(德國)，純度均≥98%。

氨基甲酸酯標準溶液的配制：稱取5種氨基甲酸酯標準物質(zhì)各0.01 g，用丙酮溶解定容至10 mL，配成1 mg/mL的標準儲備液；準確量取5種氨基甲酸酯標準儲備液各0.1 mL至同一10 mL容量瓶中，丙酮定容并混勻，配成10 μg/mL的混合標準工作液。

1.2 樣品前處理

準確稱取1 g 烏龍茶樣品至50 mL 聚丙烯離心管中，加入10 mL正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液，旋渦振蕩后超聲30 min，5 000 r/min 離心5 min，取上清液，待凈化。

將提取液加入盛有400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4的QuEChERS試劑盒中(試劑盒為15 mL離心管)，旋渦振蕩10 min，使吸附劑與提取液充分接觸；振蕩后以5 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至一潔凈試管中，氮吹至干，丙酮定容至1 mL，供 GC-MS/MS分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：色譜柱為Rxi-5 Sil MS(30 m，0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃；柱溫：柱溫箱初始溫度為50 ℃，以20 ℃/min升至180 ℃，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；載氣：高純氦氣(99.999%)，恒定流速：1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI源)；離子源電壓：70 eV；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲4 min；5種待測組分的保留時間、母離子、特征離子碎片、碰撞電壓及駐留時間信息見表1。

表1 5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的質(zhì)譜信息

* quantitative ion pairs

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS/MS方法的建立

茶葉是當(dāng)前分析測試領(lǐng)域公認的成分復(fù)雜的基質(zhì)之一，含有大量易揮發(fā)性物質(zhì)和色素，即使通過一定手段進行凈化，在分析時仍存在較大干擾，使用氣相色譜或單級質(zhì)譜分析定量均有一定難度，因此本研究采用選擇性高、抗干擾能力強及靈敏度高的串聯(lián)質(zhì)譜進行分析，并對5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的色譜條件和質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化。

實驗首先通過單一標準物質(zhì)全掃描，確定各組分的保留時間(見表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除仲丁威和殘殺威的保留時間相近外，其他3種農(nóng)藥均有很好的分離。而通過改變升溫程序仍不能較好的分離仲丁威和殘殺威，但同一時間出峰的化合物可通過多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)中離子對的響應(yīng)進行區(qū)分，對樣品中的農(nóng)藥殘留含量測定無影響，因此本研究對其分離未做進一步優(yōu)化。確定保留時間后，通過全掃描數(shù)據(jù)確定各組分的前體離子信息，確定相對豐度較大、高質(zhì)量的，且能產(chǎn)生較強響應(yīng)的碎片離子作為前體離子；再通過Smart Database MRM優(yōu)化工具確定各組分的碎片離子信息及最優(yōu)的碰撞電壓(表1)，從而建立了烏龍茶中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的GC-MS/MS檢測方法。5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的總離子流圖見圖1A。

圖1 5種氨基甲酸酯農(nóng)藥標準溶液(A)及空白樣品加標(0.05 μg/mL,B)的總離子流色譜圖

圖2 不同提取溶劑條件下5種農(nóng)藥的平均提取效率Fig.2 Average extraction efficiencies of 5 carbamate pesticides under the conditions of different extraction solvents the number denoted was the same as that in Fig.1

2.2 前處理方法的優(yōu)化

目前常用于農(nóng)藥殘留提取的溶劑主要有乙腈、正己烷、乙酸乙酯、丙酮及其混合溶液，乙腈的飽和蒸汽壓低，揮發(fā)性較低；丙酮和乙酸乙酯屬中等極性，提取能力更強。本研究比較了乙腈、乙腈-丙酮(1∶1)、正己烷及正己烷-乙酸乙酯(1∶1) 4種不同提取溶劑的提取效率(圖2)。結(jié)果顯示，正己烷的提取效率最差，而常用的乙腈及其與丙酮混合溶劑的提取效率也偏低，其原因可能是茶葉基質(zhì)較為復(fù)雜，乙腈及乙腈-丙酮混合溶液的共提取物較多，產(chǎn)生了較強的基質(zhì)效應(yīng)，從而對目標化合物的響應(yīng)產(chǎn)生了抑制，而采用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液提取時，5種農(nóng)藥的平均回收率最高。因此本研究選用正己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液對烏龍茶中5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行提取。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

烏龍茶中主要含有氨基酸、多元酚類、咖啡因、植物色素、有機酸等大量干擾成分，這些揮發(fā)性成分在氣相色譜測定時對目標組分的定量具有很大影響，因此需對樣品進行凈化，以盡可能除去基質(zhì)干擾成分。目前，對于樣品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定的凈化方法主要為固相萃取(SPE)法，該方法雖能有效除去雜質(zhì)，但操作復(fù)雜、耗時、耗溶劑。QuEChERS凈化方法主要用于農(nóng)藥殘留分析，該凈化方法具有快速、操作簡便、高效等特點，并且樣品損失大幅減少，回收率更高。其使用的PSA，C18和GCB吸附劑對碳水化合物、脂肪酸、脂類、有機酸以及色素具有很好的吸附效果。因此本研究采用QuEChERS凈化方法，選用成本低的QuEChERS試劑盒(400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4)對樣品進行凈化，并比較了相同條件下SPE固相萃取法和QuEChERS方法對烏龍茶樣品的凈化效果。結(jié)果顯示，5種農(nóng)藥在QuEChERS凈化方法下，平均回收率均高于SPE法。其原因可能是固相萃取柱在使用時由于茶葉樣品雜質(zhì)較多，易導(dǎo)致柱體堵塞，目標物未能完全洗脫；或樣品與固相萃取填料接觸時間不夠，未完全凈化，導(dǎo)致凈化后樣品基質(zhì)效應(yīng)仍明顯。空白樣品經(jīng)QuEChERS法凈化后，5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥加標的總離子流圖如圖1B所示，可以看出，樣品經(jīng)凈化后，在目標物出峰處無干擾，能夠較好的進行定量分析。

2.4 線性范圍與靈敏度

取不含該5種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的空白烏龍茶樣品，通過本研究的前處理方法提取凈化后，用該空白樣品提取液稀釋標準儲備液配制成系列濃度的基質(zhì)匹配標準工作液，采用“1.3”色譜及質(zhì)譜條件分析后，以各目標組分的濃度(X，μg/kg)與對應(yīng)的響應(yīng)峰面積(Y)繪制基質(zhì)匹配標準曲線，根據(jù)S/N≥3(信噪比)和S/N≥10分別確定方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。從表2可以看出，速滅威和殘殺威在5～500 μg/kg，其余3種農(nóng)藥在1～500 μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99；5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的LOD和LOQ分別為0.2～1.0 μg/kg和1.0～5.0 μg/kg，方法的靈敏度滿足痕量分析的要求。

表2 5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.5 方法的回收率與精密度

向空白烏龍茶樣品中添加不同濃度的5種氨基甲酸酯農(nóng)藥標準，添加水平參照GB/T 27404-2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范要求，按照優(yōu)化方法進行實驗，每個濃度做6個平行，并做空白對照，計算加標回收率和相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。從表3可以看出，在5，20，100 μg/kg 3個加標水平下，速滅威和殘殺威的平均回收率為77.5%～95.4%，RSD為2.1%～6.1%；在1，20，100 μg/kg 3個加標水平下，異丙威、仲丁威和抗蚜威的平均回收率為79.5%～102.5%，RSD為2.0%～8.2%，方法的準確度及精密度滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可應(yīng)用于烏龍茶中5種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的檢測分析。

表3 5種氨基甲酸酯農(nóng)藥的加標回收率及相對標準偏差(n=6)

3 結(jié) 論

本文建立了烏龍茶中速滅威、異丙威、仲丁威、殘殺威和抗蚜威同時測定的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的定性定量方法。采用改進的QuEChERS方法進行前處理，正己烷-乙酸乙酯混合溶液(1∶1)提取后，通過400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4的QuEChERS試劑盒進行凈化，可有效去除有機酸、脂肪酸、甾醇、色素等雜質(zhì)。采用GC-MS/MS動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式進行分析，5種氨基甲酸酯農(nóng)藥在各自線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好，檢出限和定量下限均滿足痕量殘留分析的要求。本方法前處理簡單，耗時少、成本低，能較好地排除烏龍茶基質(zhì)的干擾，可用于烏龍茶樣品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的簡便、快速、準確檢測。

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Determination of Five Carbamate Pesticides Residues in Oolong Tea by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YU Yu-cheng1，F(xiàn)ANG Ling1，SU De-sen1*，LIN Qiu1，F(xiàn)U Jian-wei1，LUO Chao2

(1.Key Laboratory of Precision Instrument and Agriculture of Fujian Province，Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology，F(xiàn)ujian Institute of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350001，China;2.Fujian Institute for Food and Drug Quality Control，F(xiàn)uzhou 350005，China)

A gas chromatography-tandem mass spectrometric(GC-MS/MS) method was developed for the determination of 5 carbamate pesticides residues，i.e，metolcarb，isoprocarb，fenobucarb，propoxur and pirimicarb in Oolong tea samples.The sample was extracted with hexane-ethyl acetate mixed solution,and the extract was cleaned up with a QuEChERS kit，including 400 mg PSA/400 mg C18/1 200 mg MgSO4.The mixed targets were separated on a Rxi-5 Sil MS(30 m，0.25 mm×0.25 μm) capillary column,and pesticide residues were identified and quantified by GC-MS/MS.5 carbamate pesticides had good linear relationships in each linear range(5-500 μg/kg for metolcarb and propoxur，1-500 μg/kg for isoprocarb，fenobucarb and pirimicarb)，and the correlation coefficients were higher than 0.99.The mean recoveries of metolcarb and propoxur in black Oolong tea at spiked levels of 5，20，100 μg/kg were in the range of 77.5%-95.4%,with RSDs(n=6) of 2.1%-6.1%.The LODs and LOQs for the two targets were 1 μg/kg and 5 μg/kg，respectively.The mean recoveries of isoprocarb，fenobucarb and pirimicarb at spiked levels of 1，20，100 μg/kg were in the range of 79.5%-102.5%with RSDs(n=6) of 2.0%-8.2%.The LODs and LOQs were 0.2 μg/kg and 1 μg/kg，respectively.With the advantages of simple operation，high sensitivity and good reproducibility,this method could meet the requirements for the determination of 5 kinds of carbamate pesticides residues in Oolong tea samples.

Oolong tea;QuEChERS;carbamate pesticides;gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)

2016-06-27；

2016-07-29

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1025-4,2015R1025-2,2016R1024-5)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.012

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2016)12-1586-05

*通訊作者：蘇德森，碩士，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與風(fēng)險評估，Tel：0591-87869475，E-mail：7592763@qq.com