許夢琪，魏立新，肖遠燦，畢宏濤，楊紅霞*，杜玉枝*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評價研究重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院藏藥重點實驗室，青海 西寧 810008；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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一種快速測定牦牛皮膠和牛皮膠中18種氨基酸的PITC柱前衍生HPLC法

許夢琪1,2,3，魏立新1,2，肖遠燦1,2，畢宏濤1,2，楊紅霞1,2*，杜玉枝1,2*

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評價研究重點實驗室，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院藏藥重點實驗室，青海 西寧 810008；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

建立一種有效測定牦牛皮膠與牛皮明膠中18 種氨基酸含量的異硫氰酸苯酯(PITC)柱前衍生-高效液相色譜法。對PITC衍生方法進行了優(yōu)化，方法無需干燥和有機溶劑萃取過量PITC的步驟。牦牛皮使用胃蛋白酶在37 ℃下酶解72 h，酶解物冷凍干燥保存。樣品用6.0 mol/L鹽酸，110 ℃水解后，以PITC為衍生試劑進行衍生處理。采用Shiseido Capcell Pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動相為0.14 mol/L乙酸鈉-0.5 mL/L三乙胺水溶液(pH 6.08)和60%乙腈，梯度洗脫，流速為 1 mL/min，檢測波長為254 nm。18種氨基酸在 0.2～80 mg/L濃度范圍內(nèi)與峰面積間的線性關(guān)系良好(r2≥0.999 2)，檢出限為0.01～0.39 mg/kg，平均回收率為78.7%～121.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.05%～12.0%。結(jié)果表明，該方法衍生化步驟簡單、靈敏度高、前處理時間短，可用于牛科動物皮膠中多種氨基酸成分和含量的測定。

牦牛皮明膠；牛皮明膠；氨基酸；柱前衍生；異硫氰酸苯酯；高效液相色譜法

牦牛(Bosgrunniens)是世界上除了人類之外生活在海拔最高處的哺乳動物，是高原畜牧業(yè)最重要的優(yōu)勢畜種[1-3]。牦牛皮膠由牦牛皮經(jīng)科學(xué)方法提煉而成，可益氣生血、健脾補腎，主要用于營養(yǎng)性貧血、久病氣虛無力等癥[4]。新鮮牛皮中蛋白質(zhì)高達30%～35%，氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位[5]。牦牛皮膠的功效與其含有的氨基酸種類及含量有密切關(guān)系[4]。因此，準(zhǔn)確測定和分析氨基酸組成及含量對于分析牦牛皮膠的功效具有重要意義。

氨基酸的分析方法主要有氨基酸分析儀測定法、柱前衍生-高效液相色譜法、衍生化毛細管電泳法和離子交換層析法(IEC)等[6]。由于柱前衍生-高效液相色譜法具有靈敏、快速的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于氨基酸的測定[7-8]。文獻報道的柱前衍生試劑主要有異硫氰酸苯酯(PITC)[9-11]、2,4-二硝基氯苯(DNCB)、鄰苯二甲醛(OPA)[12]及6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)[13]。雖然PITC作為衍生試劑時具有遇水產(chǎn)生結(jié)晶、毒性大等缺點[14]，但由于其反應(yīng)條件要求不高，反應(yīng)迅速，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[15]，且多用于膠原蛋白和明膠的測定[16]。目前，有關(guān)牦牛皮膠的氨基酸組成分析和含量測定僅見張彩旗等[17]采用氨基酸分析儀測定法和朱洪梅等[18]使用DNCB為衍生試劑進行柱前衍生-高效液相色譜法的報道，尚無使用PITC作為衍生試劑的研究。

本文采用PITC為衍生試劑，建立柱前衍生-高效液相色譜法，對衍生化步驟進行優(yōu)化，改進了PITC作為衍生試劑時的缺點，并比較了牛皮明膠與牦牛皮膠中 18 種游離氨基酸的種類及含量差異，從而為?？苿游锲つz的質(zhì)量控制提供了參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 液相色譜儀，配G1322A在線脫氣機，G1311C四元泵，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D 二極管陣列檢測器，Agilent Chemstation色譜工作站(美國Agilent公司)。KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AL104電子天平(Mettler Toledo公司)；PB-10 pH計(德國Sartorius公司)；HB-120S金屬浴加熱器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；恒溫干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；3K15離心機(美國Sigma公司)；VORTEX-5渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Milli-QA-10純水器(美國Millipore公司)。

衍生試劑異硫氰酸苯酯(純度>99%，日本TCI公司)；牛皮明膠(G9382，美國Sigma公司)；胃蛋白酶(活性：3 000～3 500，Wolsen公司)；無水乙酸鈉(分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；乙腈(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)；羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(Hyp，美國Sigma公司)，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)和苯丙氨酸(Phe)共17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(AAS18，美國Sigma公司)。三乙胺、苯酚、冰醋酸、濃鹽酸均為分析純。

1.2 實驗材料

牦牛皮明膠為自制，牛皮明膠購于美國Sigma公司。

牦牛皮明膠制備方法：牦牛皮原料購于青海百德食品有限公司。將整張新鮮未處理的牦牛皮浸泡，洗凈雜物，分割成大小為30 cm×30 cm塊狀。用NaOH溶液浸泡48 h后進行脫毛處理。將脫毛后的牦牛皮置于清水中浸泡至pH值呈中性。浸泡脫堿后，分別用丙酮、乙醚、丙酮進行脫脂。脫脂后的牛皮用蒸餾水沖洗至無異味。處理好的牛皮加入0.1 mol/L甘氨酸緩沖液進行勻漿處理，加胃蛋白酶，質(zhì)量比為酶∶明膠=1∶99，37 ℃下水解72 h后離心，上清液用濾紙過濾后，冷凍干燥待進一步分析。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液:取氨基酸對照品溶液100 μL，加2 mL 6 mol/L鹽酸于110 ℃水解24 h，加入羥脯氨酸粉末25 mg進行衍生后，4 ℃避光保存。

含1%苯酚的6 mol/L HCl：取36.5%的濃鹽酸49.5 mL，加入49.5 mL超純水和1 mL苯酚即得。

衍生試劑 A：甲醇、超純水和三乙胺按照2∶2∶1的體積比配成。

衍生試劑 B：甲醇、超純水、三乙胺和PITC按照7∶1∶1∶1的體積比配成。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液和樣品的水解 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液水解：取17種氨基酸混合標(biāo)液1 mL于安瓿瓶中，加入2 mL含1%苯酚的6 mol/L鹽酸溶液，充氮氣密封后置于120 ℃恒溫干燥器中24 h。冷卻至室溫，用pH 7.5 PBS定容至5 mL，待用。

樣品水解：取10 mg牦牛皮膠樣品置于安瓿瓶中，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液水解。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液和樣品的衍生 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液衍生：取40 μL水解后的氨基酸混合液，于金屬浴120 ℃加熱15 min使鹽酸揮發(fā)。再加40 μL衍生試劑A，于渦旋振蕩器混合后，再加入120 μL衍生試劑B，置于渦旋振蕩器混合1 min。上述溶液在室溫下(20～25 ℃)靜置20 min后，加入300 mL pH 7.5 PBS緩沖液混勻，用0.45 μm濾膜過濾待用。

樣品衍生：取40 μL水解后的樣品溶液，其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液衍生。

1.3.4 色譜條件 色譜柱：Shiseido Capcell Pak C18(4.6 mm×250 mm，5 μm；日本Shiseido公司);柱溫:25 ℃;樣品室溫度:20 ℃。流動相 A:0.14 mol/L乙酸鈉-0.5 mL/L三乙胺水溶液(用冰醋酸調(diào)至pH 6.08);流動相B:60%乙腈;流速:1 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：7 μL。采用梯度洗脫：0.0～10.0 min，90%～50% A；10.0～15.0 min，50%～0% A；15.0～23.0 min，0%A；23.0～24.0 min，0%～90% A；24.0～30.0 min，90%A。

圖1 18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同pH值條件下的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 18 kinds of amino acids in different pH values peaks:1.Asp，2.Glu，3.Hyp，4.Ser，5.His，6.Gly，7.Arg，8.Thr，9.Pro，10.Ala，11.Cys，12.Tyr，13.Val，14.Met，15.Ile，16.Leu，17.Phe，18.Lys；pH value(a-e)：5.49，6.00，6.08，6.35，6.75

圖2 3種干燥方法對氨基酸對照品中18種氨基酸衍生效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of three different methods of drying on the derivatives of 18 amino acids(n=3)

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生條件和色譜條件的優(yōu)化

圖3 萃取和過濾對氨基酸對照品中18種氨基酸含量的影響(n=3)Fig.3 Effect of filtration and extraction on content of 18 amino acids reference solution (n=3)

2.1.1 pH值的優(yōu)化 由于氨基酸為兩性物質(zhì)，緩沖液pH值會影響到不同氨基酸的離解程度，從而影響氨基酸的保留值。Bidlingmeyer等[19]在實驗中選擇pH 6.35的流動相A(0.14 mol/L乙酸鈉-0.5 mL/L三乙胺水溶液)，而本研究發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有實驗條件下，pH 6.35并不能很好地分離18種氨基酸。本實驗用18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品考察了流動相A的pH值分別在5.49，6.00，6.08，6.35和6.75 時18種氨基酸的分離效果(見圖1)。結(jié)果顯示，隨著流動相A的pH值增大，18種氨基酸的保留值向后漂移，當(dāng)流動相A的pH值為6.75時不能完全分離出18種氨基酸；當(dāng)流動相A的pH值為6.08時，18種氨基酸的分離效果最好。故本實驗選擇流動相A(0.14 mol/L乙酸鈉-0.5 mL/L三乙胺水溶液)的pH 值為6.08。2.1.2 干燥方法的優(yōu)化 Bidlingmeyer等[19]在進行氨基酸衍生時每步均需真空干燥，然而由于樣品量極少，進行真空干燥時樣品損失較大，故本實驗對干燥方法進行了優(yōu)化，用18種氨基酸對照品考察了加熱干燥(金屬浴120 ℃，10 min)、冷凍干燥(冷凍干燥機，2 h)和不干燥3種方法對18種氨基酸含量測定的影響。結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，加熱干燥法測定時亮氨酸和異亮氨酸的色譜峰未能分開，而采用不加熱的方法測得的氨基酸含量顯著高于其他兩種方式(P<0.05)。

2.1.3 樣品衍生化過程的優(yōu)化 考察了衍生完畢后，用有機試劑萃取氨基酸和直接過濾結(jié)晶兩種方法對氨基酸含量和衍生試劑PITC含量的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，萃取后的氨基酸含量與過濾后的氨基酸含量無顯著差異(P>0.05)。衍生后直接過濾方法測出的PITC峰面積值為12 201.93，衍生后萃取方法測出的PITC峰面積為21 334.24。由此可以判斷出PITC接觸水生成結(jié)晶，可以直接降低PITC的濃度，過濾后不會影響氨基酸的含量。并且過濾操作簡單、節(jié)約試劑和時間。所以，本實驗最終采用過濾的方法作為衍生化后處理步驟。

同時對衍生試劑用量、衍生化反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度進行優(yōu)化，得樣品、衍生試劑A與衍生試劑B的最佳體積比為1∶1∶3，反應(yīng)時間為20 min，且衍生化過程在室溫(20～25 ℃)時衍生化效果最好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限 對“1.3.1”制備的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液用pH 7.5 PBS緩沖液逐級稀釋6次，采用峰保留時間比較法定性，外標(biāo)法定量。以氨基酸溶液的濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(y，mAU)為縱坐標(biāo)，得到18種氨基酸的回歸方程。由表1可見，在0.2～80 mg/L范圍內(nèi)，氨基酸的峰面積與其濃度的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～1.000 0。分別以信噪比S/N=3和S/N=10確定各氨基酸的方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得18種氨基酸的LOD為0.01～0.39 mg/kg，LOQ為0.03～1.29 mg/kg(見表1)。

表1 18種氨基酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)，線性范圍，檢出限及定量下限

2.2.2 回收率、精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性 取牛皮明膠12份，每份20 mg，其中9份平均分為 3 組，按其中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高(120%)、中(100%)、低(80%)濃度水平分別加入18種氨基酸對照品儲備液，剩余3份樣品中加入與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積的pH 7.5 PBS緩沖液作為對照;按所建立的方法對樣品進行處理及測定，18 種氨基酸的加標(biāo)回收率見表2。由表2可見，在上述加標(biāo)水平下，18 種氨基酸的回收率為78.7%～121.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.05%～12.0% 。按2015版《中國藥典》附錄HPLC法指導(dǎo)原則考察精密度和重復(fù)性，RSD均小于3%；供試品溶液在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD均小于5%?？梢娫摲椒ň哂休^高的回收率，較好的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性，可以滿足明膠樣品中 18 種氨基酸含量的檢測需要。在優(yōu)化條件下，18種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白衍生化溶液及牦牛皮明膠樣品衍生化溶液的色譜圖見圖4。

表2 牛皮明膠中18種氨基酸的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

Table 2 Recoveries and RSDs of 18 amino acids spiked in gelatin from bovine skin(n=3)/%

No．AminoacidLowMiddleHighRecoveryRSDRecoveryRSDRecoveryRSD1Asp8021478816787342Glu9360679470969520483Hyp10800781096411088244Ser109007411190611120145His1007171011381986256Gly10910681112371111227Arg9642896024965168Thr98906399117987369Pro112005411424311393610Ala103106810424010292311Cys98412011203098400512Tyr1091869911910911913Val10220381047062103903914Met9660981002309723915Ile8105089145102506316Leu105105010743910623117Phe788035815148191318Lys1136201173231210085

圖4 牦牛皮明膠衍生化溶液(a)、空白衍生化溶液(b)及18種氨基酸對照品衍生化溶液(c)的 HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms from the test derivative solution of gelatin from Yak(a)，blank derivative solution(b) and the reference derivative solution of 18 amino acids(c)the number denoted was the same as that in Fig.1

2.3 實際樣品測定

按照本方法檢測牦牛皮明膠和牛皮明膠中18種氨基酸的含量，測定結(jié)果如表3所示。由檢測結(jié)果可看出，牛皮明膠和牦牛皮膠內(nèi)均含有豐富的氨基酸，甘氨酸和酪氨酸含量相差較大，差幅分別為19.04%和38.34%；其余16種氨基酸含量基本相似。牦牛皮明膠在提取時由于在溶液中加入了0.1 mol/L甘氨酸，因此與牛皮明膠中的甘氨酸含量相差較大。同時，牦牛皮明膠和牛皮明膠中的特征氨基酸—脯氨酸和羥脯氨酸的含量均較高。本實驗測定的氨基酸含量與張彩旗等[17]用氨基酸分析儀測得牦牛皮膠中的氨基酸含量基本相同(P<0.05)。

3 結(jié) 論

本文以PITC作為衍生試劑進行柱前衍生化，建立了柱前衍生-高效液相色譜測定牛和牦牛皮明膠中的氨基酸成分及含量。本文所建立的檢測方法在0.2～80 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～1.000 0，檢出限為0.01～0.39 mg/kg，3個添加水平下的回收率為78.7%～121.0%，RSD為0.05%～12.0%，完成一次測定用時24 min，動物皮明膠中的氨基酸成分在普通C18色譜柱上能實現(xiàn)很好的分離。該方法準(zhǔn)確、可靠，可為動物皮膠來源與品質(zhì)鑒定、營養(yǎng)狀況評估和研究動物皮膠的生理意義提供一定的參考。

表3 牛皮明膠和牦牛皮膠中氨基酸的含量(n=3)

Table 3 Contents of amino acids in gelatin from bovine skin and Yak skin(n=3)w/(mg·g-1)

AminoacidGelatinfrombovineskinGelatinfromYakskinAminoacidGelatinfrombovineskinGelatinfromYakskinAsp4370±871?4389±868Glu7586±12957433±1062Hyp7797±1427107±130Ser2147±3422073±394His689±122713±143Gly15502±47418465±1043Arg5716±10525659±1134Thr2262±0712112±030Pro8761±1947817±119Ala5996±10395705±1021Cys1636±0791753±076Tyr373±004516±025Val1532±2161504±242Met509±177558±104Ile1921±6161989±703Leu4424±2234487±078Phe1321±3141366±211Lys2226±3852190±356

* values are given as mean±SD from triplicate determinations

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Determination of 18 Amino Acids in Gelatin from Bovine and Yak by High Performance Liquid Chromatography Coupled with Precolumn Derivatization

XU Meng-qi1,2,3，WEI Li-xin1,2，XIAO Yuan-can1,2，BI Hong-tao1,2，YANG Hong-xia1,2*，DU Yu-zhi1,2*

(1.Qinghai Key Laboratory of Tibetan Medicine Pharmacology and Safety Evaluation，Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China;2.Key Laboratory of Tibetan Medicine Research，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China;3.University of Chinese Academic of Sciences，Beijing 100049,China)

A rapid quantitative method of high performance liquid chromatograpy(HPLC) was developed for the analysis of 18 amino acids in gelatin from bovine skin and Yak skin.The steps of sample derivatization with PITC were optimized.The method was no need for drying-down and extraction with organic solvent.The yak leather was enzymatically hydrolyzed at 37 ℃ for 72 h with pepsin，and then was freeze-dried.The sample was then hydrolyzed with 6.0 mol/L HCl at 110 ℃.After the hydrolyzation，the solution was derivatized with phenyl isothiocyanate(PITC).Gradient HPLC separation was performed on a Shiseido Capcell Pak C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm) with 0.14 mol/L sodium acetate-0.5 mL/L triethylamine solution(pH 6.08，adjusted with glacial acetic acid) and 60% acetonitrile as mobile phases at a flow rate of 1 mL/min.The detection was carried out with an ultraviolet detector,and the wavelength was set at 254 nm.The calibration curves were linear in the range of 0.2-80 mg/L with correlation coefficients(r2) not less than 0.999 2.The limits of detection for the method were in the range of 0.01-0.39 mg/kg,and the average recoveries were 78.7%-121.0% with RSDs of 0.05%-12.0%.The derivatization steps were simple and sensitive，and the sample pretreatment time was short.The method was suitable for the rapid identification and determination of amino components in gelatin from bovid.

gelatin from Yak;gelatin from bovine;amino acid;precolumn derivatization;phenyl isothiocyanate(PITC);high performance liquid chromatography(HPLC)

2016-06-17；

2016-08-29

青海省自然科學(xué)基金青年項目(2015-ZJ-924Q)；中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)引進計劃

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.12.008

O657.72;O629.711

A

1004-4957(2016)12-1563-06

*通訊作者：杜玉枝，研究員，研究方向：藏藥藥理及新產(chǎn)品開發(fā)，Tel:0971-6132480,E-mail：yzdu@nwipb.cas.cn 楊紅霞，博士，助理研究員，研究方向：藏藥藥理，Tel:0971-6132480,E-mail:hxyang@nwipb.cas.cn