徐峰，葉青，王靜，楊永紅

(1天津市第三中心醫(yī)院分院，天津300250；2天津市第三中心醫(yī)院；3天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

178例肝細胞癌患者DNA甲基轉移酶3A基因rs1550117位點多態(tài)性檢測及意義

徐峰1，葉青2，王靜3，楊永紅1

(1天津市第三中心醫(yī)院分院，天津300250；2天津市第三中心醫(yī)院；3天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

目的 探討DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)基因rs1550117位點多態(tài)性與肝細胞癌發(fā)生的關系。方法 采用Sequenom MassArray質譜陣列技術，檢測天津漢族人群178例肝細胞癌患者(觀察組)及188例健康人(對照組)DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性。結果 觀察組DNMT3A基因rs1550117位點基因型AA、AG、GG頻率分別為4.5%、36.0%、59.5%，等位基因G、A頻率分別為81.3%、18.7%；對照組基因型AA、AG、GG頻率分別為3.2%、29.4%、67.4%，等位基因G、A頻率分別為83.8%、16.2%；兩組比較P均>0.05。結論 DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與肝細胞癌的發(fā)生無明顯關系。

肝細胞癌；DNA甲基轉移酶3A；基因位點多態(tài)性

肝細胞癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生涉及多基因調控、多信號通路，根源是多基因的異常表達[1～3]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是導致及反映個體腫瘤遺傳易感差異的重要原因之一[4]。原癌基因激活及抑癌基因失活是肝細胞癌發(fā)生的分子基礎[5]。抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的重新甲基化可能是抑癌基因失活的機制之一[6]，其過程由DNA甲基轉移酶(DNMT)家族催化。DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)基因是DNMT家族重要成員之一，位于人染色體2p23。研究發(fā)現，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性參與胃癌、結腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其與肝癌的關系報道較少。本研究分析178例肝細胞癌患者DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性，探討其與肝細胞癌發(fā)生的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年12月在天津市第三中心醫(yī)院、天津市第三中心醫(yī)院分院和天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院確診的肝細胞癌患者178例(觀察組)，男92例、女86例，年齡(53.7±12.3)歲；肝功能Child-Push分級:A級28例，B級89例，C級61例；AFP>500 ng/mL 40例，200～500 ng/mL 72例，<200 ng/mL 66例；彌漫型41例，結節(jié)性89例，小肝癌48例；包膜完整52例，有血管浸潤77例，合并門脈癌栓33例。TNM分期：T1～4期分別為19、36、79、44例；N 0、1期分別為127、51例；M0、1期分別為136、42例。患者均根據臨床表現及影像學檢查、肝穿刺活檢、手術切除組織病理檢查結果確診，且臨床資料完整。選取同期體檢健康者188例為對照組，男98例、女90例，年齡(54.6±13.2)歲。兩組性別、年齡具有可比性。兩組均系天津市漢族人群，個體間均無血緣關系。調查和取樣均征得患者同意，并經過天津市第三中心醫(yī)院分院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性檢測 ① DNA提?。河^察組入院時(均未行放化療或其他抗腫瘤藥物治療)、對照組體檢時均采集外周靜脈血3～4 mL，采用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細胞基因組DNA，步驟參照試劑盒說明書。采用紫外分光光度計進行DNA濃度測定，標化濃度>25 ng/μL，純度OD260/OD280≥1.7，OD260/OD230≥1，樣本量>20 μL。提取好的DNA保存于-80 ℃冰箱備用。②引物的設計與合成：采用Sequenom MassArray Design3.1軟件設計DNMT3A基因rs1550117位點的PCR引物，其中特異性擴增引物1 st序列為5′-ACGTTGGATGCACCTCTGTCTAATTCCACC-3′，擴增引物2 nd序列為5′-ACGTTGGATGCTGCTGGAGGAGTGAGATG-3′；延伸引物序列為5′-ACGTTGGATGCTGCTGGAGGAGTGAGATG-3′。根據引物濃度計算加入雙蒸水的量，稀釋單管擴增引物濃度至100 μmol/L，加入雙蒸水混合使各引物濃度為0.5 μmol/L；稀釋單管延伸引物濃度至500 μmol/L，加入雙蒸水混合使各引物濃度為8 μmol/L。③基因分型：利用Sequenom MassArray質譜陣列技術對DNMT3A基因rs1550117位點進行基因分型。具體方法：a. PCR擴增：5.0 μL PCR反應體系：1.0 μL DNA樣本、1.8 μL水、5.0 μL PCR緩沖液、0.1 μL dNTP、0.4 μL MgCl2、1.0 μL PCR引物及0.2 μL酶；PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)，最終72 ℃延伸3 min。b. 堿性磷酸酶反應及單堿基延伸：2.0 μL SAP混合液由1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3 μL SAP酶構成。SAP反應條件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。堿性磷酸酶處理后針對SNP進行單堿基延伸：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min。c.測序：將分型產物用樹脂脫鹽后經自動點樣儀點樣于384孔板PCR儀(384-element Spectro CHIP)上，并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行分析，最終結果由MassArray RT軟件系統(tǒng)進行實時讀取，分析基因分型。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。采用Hardy-Weinberg平衡軟件進行遺傳平衡檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組等位基因和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，均具有群體代表性。兩組DNMT3A基因rs1550117位點基因型及等位基因分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 兩組DNMT3A基因rs1550117位點基因型和等位基因分布[例(%)]

3 討論

SNP是在基因組水平上由單個核苷酸變異(置換、顛換、缺失和插入)引起的一種DNA序列多態(tài)性，已經被作為第3代遺傳標志[7]。Sequenom MassArray質譜陣列技術其基本原理為基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術，具有高通量的檢測系統(tǒng)，可以高效自動化篩查SNP，適合大規(guī)模篩查的需要。

DNMT3A是DNA甲基轉移酶家族中重要的從頭甲基化酶，其通過調節(jié)細胞內甲基化過程而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。DNMT3A基因rs1550117位點位于CpG啟動子區(qū)，該位點基因突變與腫瘤的相關性研究國內外已有報道，尤其是與胃癌的關系報道較多，但結論差異較大。Fan等[8]發(fā)現，在中國江蘇漢族人群中，DNMT3A啟動子區(qū)rs1550117位點多態(tài)性與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有明顯的相關性，其潛在機制可能和G>A變異型的高度活躍有關，提示DNMT3A多態(tài)性可以作為胃癌基因易感性的指標。Wang等[9]對吉林胃癌人群的研究發(fā)現，DNMT3A基因rs1550117位點AG或AA基因型患者比GG基因型患者具有更短的生存期及更高的死亡風險，提示rs1550117基因多態(tài)性與胃癌患者預后相關，其可能是預測胃癌患者總生存期的潛在生物標記物。Cao等[10]研究發(fā)現，DNMT3A基因rs1550117位點AA基因型人群幽門螺桿菌感染風險較GG、AG基因型人群明顯增加，但未發(fā)現其基因多態(tài)性和萎縮性胃炎及胃癌有明顯相關性。Yang等[11]在針對廣州人群的研究未發(fā)現DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與胃癌相關。上述結果提示，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與胃癌的關系可能存在地域的差異性，且DNMT3A活性改變和rs1550117位點錯義突變之間的潛在關聯尚待明確。

另外，研究者們還對DNMT3A基因多態(tài)性與卵巢癌、乳腺癌、結腸癌等的關系進行研究，結論差異亦較大。例如，波蘭人群DNMT3A基因包括rs1550117在內的5個位點多態(tài)性和卵巢癌的發(fā)病、發(fā)展無明顯相關性[12]，但rs1550117多態(tài)性位點可能是避免機體患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的原因之一[13]；Szczepańska等[14]研究未發(fā)現DNMT3A 基因rs1550117等5個位點多態(tài)性與子宮內膜異位癥及子宮內膜異位癥相關的不孕癥有關；Sun等[15]研究未發(fā)現DNMT3A基因rs1550117等6個位點多態(tài)性與乳腺癌有相關性；Zhao等[16]報道，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性和結直腸癌的基因易感性有關，其可能作為預測結直腸癌發(fā)病的分層指標，尤其適用于50歲以上的男性個體；Ling等[17]研究發(fā)現，DNMT3A基因rs1550117位點AA基因型個體罹患遲發(fā)性阿爾茨海默病的風險是GG基因型的2.08倍，是GG+GA基因型的2.05倍，表明DNMT3A基因多態(tài)性在遲發(fā)性阿爾茨海默病的發(fā)病中發(fā)揮一定作用，可以作為預測個體對遲發(fā)性阿爾茨海默病易感性的分層標記物。上述研究結果提示，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與不同疾病發(fā)生、發(fā)展的關系不同，可能與種族的遺傳背景、飲食結構及環(huán)境暴露等因素不同有關。

目前，國內外關于DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與肝細胞癌的關系報道較少。本研究兩組DNMT3A基因rs1550117位點的基因型及等位基因分布頻率的差異均無統(tǒng)計學意義，提示肝細胞癌的發(fā)生與DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性無明顯相關性。但本研究樣本量較小，且受試對象來源地域單一，結果有待增加樣本量、擴大研究地域，多中心、分層研究明確。

綜上所述，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與肝癌的發(fā)生無明顯關系。

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楊永紅(E-mail: 754156284@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.026

R735.7

B

1002-266X(2016)44-0072-03

2016-03-24)