孫志欣，張瑩

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300381)

糙葉敗醬堿對肺癌SPC-A1細胞增殖的影響及機制

孫志欣，張瑩

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津300381)

目的 觀察糙葉敗醬堿對肺癌SPC-A1細胞增殖的影響，探討其作用機制。方法 取對數生長期的人肺腺癌SPC-A1細胞，分別加入適量糙葉敗醬堿，使其終濃度為0、5、10、15、20、30、40μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24、48h，檢測細胞增殖情況，結果顯示糙葉敗醬堿呈劑量和時間依賴性抑制細胞增殖，最終選用高于及低于半數抑制濃度的10、20μmol/L糙葉敗醬堿處理48h進行后續(xù)研究。取對數生長期的SPC-A1細胞，分別加入0、10、20μmol/L糙葉敗醬堿處理48h，通過流式細胞儀檢測G0/G1、S、G2/M期細胞百分比及細胞凋亡率，采用熒光實時定量PCR法檢測p21、p53、Bax、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、血管內皮生長因子(VEGF)、Bcl-2mRNA相對表達量，采用Caspase-3、Caspase-8活性檢測試劑盒檢測二者活性(以OD值表示活性)。結果 與未加糙葉敗醬堿(0μmol/L)細胞比較，10、20μmol/L糙葉敗醬堿處理的細胞G0/G1期細胞百分比增加，凋亡率增加，p21、p53、BaxmRNA表達升高，VEGF、CDK1、Bcl-2mRNA表達降低，Caspase-3和Caspase-8活性增加，P均<0.05。結論 糙葉敗醬堿可抑制肺癌SPC-A1細胞增殖，激活CDK1、p51、p53等介導的凋亡途徑促進細胞凋亡、阻滯細胞周期，可能是其作用機制。

肺癌；糙葉敗醬堿；細胞增殖；細胞凋亡

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。手術聯合放化療是肺癌的主要治療方法，但化療藥物毒副作用大，許多患者無法耐受而放棄治療[2,3]。糙葉敗醬屬于敗醬科敗醬屬植物，具有鎮(zhèn)靜、抗菌、提高免疫力等生物學活性；其化學成分主要有三萜類及其皂苷類化合物、黃酮類化合物、環(huán)稀醚萜類化合物及生物堿等。糙葉敗醬堿是從糙葉敗醬中提取的活性成分，屬于N苯甲?；奖彼?2-乙酰胺基苯丙醇酯[4,5]。近年研究發(fā)現，糙葉敗醬堿具有抗腫瘤作用，是一種極有應用價值的抗癌新藥[6,7]。2015年11月～2016年1月，本研究觀察了糙葉敗醬堿對肺癌SPC-A1細胞增殖的影響，現分析結果，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 糙葉敗醬堿(純度95%)為本室提取，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，配成濃度為50 mmol/L的儲存液，-20 ℃保存，使用前用RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。人肺腺癌細胞SPC-A1購自上海生命科學研究院細胞生物學研究所。CCK-8試劑盒、Caspase-3及Caspase-8活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；細胞周期和凋亡檢測試劑盒購于美國BD Bioscience公司；實時熒光定量PCR試劑盒和PrimeScript RT-PCR反轉錄試劑盒購自Takara公司；p21、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、血管內皮生長因子(VEGF)、Bcl-2、Bax、p53抗體和相應二抗均購于Santa Cruz公司。

1.2 糙葉敗醬堿實驗濃度、作用時間確定 人肺腺癌細胞SPC-A1培養(yǎng)于含10% 胎牛血青的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下孵育，取對數生長期細胞接種于96孔板，隨機分為七組，分別加入適量糙葉敗醬堿，使其終濃度為0、5、10、15、20、30、40 μmol/L，分別于培養(yǎng)24、48 h時采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞增殖情況(具體步驟參照試劑盒說明書)，計錄各組450 nm處吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。結果顯示，糙葉敗醬堿可抑制SPC-A1細胞增殖，并且其抑制作用呈濃度和時間依賴性。糙葉敗醬堿處理24、48 h時對SPC-A1細胞生長抑制的半數抑制濃度(IC50)分別為(27±0.016)、(16±0.023)μmol/L。后續(xù)實驗選用高于及低于IC50的10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h。

1.3 糙葉敗醬堿干預及相關指標觀察 ①細胞周期：取對數生長期SPC-A1細胞，調整細胞密度為2×105個/mL接種于6 cm培養(yǎng)皿，分別加入0、10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h，流式細胞儀分析細胞周期，計算G0/G1、S、G2/M期細胞百分比。②細胞凋亡情況：取對數生長期SPC-A1細胞，調整細胞密度為5×104個/孔接種于6孔板，分別加入0、10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h，收集各組細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。③細胞p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA表達：將對數生長期SPC-A1細胞以5×104個/孔接種于6孔板，分別加入0、10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h，收集細胞，采用熒光實時定量RT-PCR法檢測p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA的相對表達量。④細胞Caspase-3和Caspase-8活性：取步驟③收集的各組細胞，采用Caspase-3、Caspase-8活性檢測試劑盒檢測二者活性，步驟均參照試劑盒說明書，采用酶標儀測定450 nm波長處各組吸光度(OD)值，以此表示Caspase-3、Caspase-8的相對活性。

2 結果

2.1 細胞周期及細胞凋亡率 10、20μmol/L糙葉敗醬堿干預后細胞G0/G1期細胞百分比及細胞凋亡率均高于未加糙葉敗醬堿(0μmol/L)細胞(P均<0.05)。見表1。

表1 不同濃度糙葉敗醬堿處理48 h時 SPC-A1細胞周期分布和凋亡率比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與10 μmol/L比較，△P<0.05。

2.2 p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA表達 10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h細胞p21、p53、Bax mRNA表達高于未加糙葉敗醬堿細胞，VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA表達低于未加糙葉敗醬堿細胞，P均<0.05。見表2。

表2 不同濃度糙葉敗醬堿處理48 h時SPC-A1細胞p21、p53、Bax、VEGF、CDK1、Bcl-2 mRNA相對表達量比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05；與10 μmol/L比較，△P<0.05。

2.3 Caspase-3、Caspase-8活性 10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h細胞Caspase-3和Caspase-8相對活性均高于未加糙葉敗醬堿細胞(P均<0.05)。見表3。

3 討論

糙葉敗醬作為藥用植物具有豐富的生物學活性，其中糙葉敗醬總木脂素、總皂苷對體外培養(yǎng)的肺癌SPC-A1細胞、 肝癌HepG2細胞和白血病K562細胞的生長均具有抑制作用，且抑制作用與藥物濃度及作用時間相關[8,9]，但其具體作用機制尚未明確。

本研究發(fā)現， 糙葉敗醬堿可將肺癌SPC-A1細胞阻滯于G0/G1期，并抑制細胞增殖、促進細胞凋亡，且上述作用呈現濃度依賴性增加的趨勢。VEGF在新生血管生成中發(fā)揮重要作用，是介導腫瘤細胞新生血管生長的關鍵因素[15]。本研究結果顯示，糙葉敗醬堿可下調VEGF表達，提示糙葉敗醬堿對肺癌細胞的抑制作用可能與阻斷新生血管生長有關。CDK1通過與cyclin形成復合物使目標底物磷酸化，調節(jié)細胞周期[10]；p21通過與細胞周期蛋白、CDK結合為周期素依賴激酶(CDKs)復合物，導致細胞周期阻滯，阻斷細胞增殖過程[11]；p53蛋白可激活p21，使其發(fā)揮細胞周期抑制作用，并修復受損的DNA，還可促進DNA修復不成功的細胞進入凋亡程序[12]。本研究發(fā)現，糙葉敗醬堿可抑制CDK1表達，促進p53和p21表達，提示調控CDK1、p21、p53表達，介導DNA損傷修復，可能亦是糙葉敗醬堿抑制肺癌細胞增殖的作用機制。Bcl-2 基因是凋亡基因Bcl-2家族的重要成員，對細胞凋亡有明顯的抑制作用[13]；Bax基因也是Bcl-2家族的重要成員，主要發(fā)揮促凋亡作用，亦可與Bcl-2等抗凋亡因子協同作用調控細胞的凋亡過程[14]。凋亡發(fā)生機制中最關鍵的環(huán)節(jié)之一是Caspase-3激活并引發(fā)級聯反應。Caspase-8通常以酶原的形式存在，被Caspase-3激活后可進一步激活下游凋亡基因，發(fā)生促凋亡功能。Bcl-2是 Caspase-3的上游基因，通過抑制Caspase-3激活而發(fā)揮作用[15]。Bcl-2還是Caspase-3的直接底物，Caspase-3激活后可特異性酶解Bcl-2片段，使Bcl-2從抑制凋亡變?yōu)橛|發(fā)凋亡[16～18]。本研究10、20 μmol/L糙葉敗醬堿處理48 h SPC-A1細胞Bax表達明顯高于、Bcl-2表達明顯低于未加糙葉敗醬堿細胞，進一步活化Caspase-3和Caspase-8，促進凋亡的發(fā)生。

表3 不同濃度糙葉敗醬堿處理48 h時SPC-A1細胞Caspase-3、Caspase-8相對活性比較

注：與0 μmol/L比較，*P<0.05。

綜上所述，糙葉敗醬堿可抑制肺癌SPC-A1細胞增殖、促進細胞凋亡，激活CDK1、p51、p53介導的凋亡途徑，調節(jié)Bax、Bcl-2等基因表達，活化Caspase-3、Caspase-8可能是其作用機制。

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