夏小慧，陳娟，張日東，章向成，張紅，李偉

(1徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221000；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一人民醫(yī)院；3徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

利拉魯肽對糖尿病大鼠腎損傷的影響及機(jī)制

夏小慧1，陳娟2，張日東2，章向成2，張紅2，李偉3

(1徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇徐州221000；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一人民醫(yī)院；3徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 探討利拉魯肽對糖尿病大鼠腎損傷的影響及其作用機(jī)制。方法 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為四組，模型組及觀察組給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg)建立糖尿病模型，觀察組、利拉魯肽組給予腹腔注射利拉魯肽200 μg/(kg·d)，模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水，均連續(xù)注射8周。藥物干預(yù)8周結(jié)束時收集各組24 h尿液，計(jì)算尿白蛋白/肌酐、體質(zhì)量及血清糖化血紅蛋白(HbA1c)，采用HE、六胺銀染色觀察腎組織形態(tài)，采用免疫組化法檢測腎小球及腎小管CD14陽性細(xì)胞的累積光密度(IOD)值，采用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6，采用Western blotting法檢測核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、細(xì)胞黏附因子1(ICAM-1)及胰高血糖素樣肽1受體(GLP-1R)蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組和利拉魯肽組比較，模型組和觀察組體質(zhì)量減低、血清HbA1c水平及尿白蛋白/肌酐升高(P均<0.01)，且觀察組尿白蛋白/肌酐低于模型組(P<0.01)。光鏡下觀察到模型組腎小球體積增大，腎小球及腎小管細(xì)胞數(shù)目增多；觀察組腎小管和腎小球損害明顯減輕，腎小球及腎小管細(xì)胞數(shù)量下降，銀染顆粒明顯減少。模型組腎組織CD14的IOD值及血清TNF-α、1L-6、IL-1β水平均較對照組、利拉魯肽組升高，觀察組上述指標(biāo)均較模型組降低(P<0.05或<0.01)。與模型組比較，觀察組腎組織NF-κB、ICAM-1蛋白相對表達(dá)量減低，GLP-1R蛋白相對表達(dá)量升高；組間比較P均<0.05。結(jié)論 利拉魯肽可抑制糖尿病大鼠腎損傷，抑制NF-κB活化后介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)GLP-1R分泌可能是其作用機(jī)制。

糖尿病腎病；利拉魯肽；核轉(zhuǎn)錄因子κB；細(xì)胞黏附因子1；胰高血糖素樣肽1受體；大鼠

糖尿病腎病(DKD)是導(dǎo)致糖尿病患者致殘和致死的主要原因之一[1]，其發(fā)生機(jī)制主要包括高血糖直接損傷腎臟、晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積、多元醇通路激活、氧化應(yīng)激及蛋白激酶通路激活等[2,3]；此外，高血糖所致炎癥反應(yīng)可加速細(xì)胞外基質(zhì)的分泌及腎臟細(xì)胞的損傷，參與DKD的發(fā)生、發(fā)展[4]。胰高血糖素樣肽1(GLP-1)是由末端空腸、回腸和結(jié)腸L細(xì)胞分泌，通過與其受體(GLP-1R)結(jié)合而發(fā)揮降糖作用，但半衰期僅2 min[5]。利拉魯肽是一種長效GLP-1類似物，半衰期長達(dá)10 h。研究發(fā)現(xiàn)，給予正常人GLP-1激動劑可以上調(diào)GLP-1R表達(dá)，延緩腎損害，但具體作用機(jī)制尚不明確[6,7]。2014年10月～2015年6月，本研究觀察了利拉魯肽對糖尿病大鼠腎損傷的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級8周齡雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司[動物許可證號：(SCXK(滬)2013-0016]。利拉魯肽，諾和諾德公司；鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司；ELISA試劑盒，Bender Med Systems GmbH公司；CD14、細(xì)胞黏附因子1(ICAM-1)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)一抗，CST公司；GLP-1R一抗，Abcam公司；羊抗兔二抗，優(yōu)寧維公司。

1.2 動物分組及處理 將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、利拉魯肽組、觀察組，每組10只。模型組及觀察組給予一次性腹腔注射STZ(60 mg/kg)建立糖尿病模型(給予STZ 72 h后檢測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠模型建立成功，兩組模型制備均成功)，觀察組、利拉魯肽組給予腹腔注射利拉魯肽200 μg/(kg·d)，模型組和對照組腹腔注射等量生理鹽水，均連續(xù)注射8周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 尿白蛋白/肌酐、體質(zhì)量和血清糖化血紅蛋白(HbA1c) 藥物干預(yù)8周結(jié)束時使用代謝籠收集各組24 h尿液，應(yīng)用雙縮脲比色法測定尿白蛋白和肌酐，計(jì)算尿白蛋白/肌酐；測定大鼠體質(zhì)量；經(jīng)腹主動脈采血后處死大鼠，采用親和層析法檢測HbA1c水平。

1.3.2 血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平 采用ELISA法。取各組血清，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β、IL-6，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各組吸光度(A)值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3.3 腎組織形態(tài) 取出大鼠雙側(cè)腎臟，生理鹽水充分灌洗，濾紙吸干水分，去除包膜及結(jié)締組織，切割成5 mm×5 mm×5 mm大小組織塊；取一部分組織經(jīng)10%甲醛固定2 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4～5 μm厚連續(xù)切片；分別進(jìn)行HE、六胺銀染色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)。

1.3.4 腎組織CD14表達(dá) 采用免疫組化法。取各組腎組織石蠟切片，二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，去離子水孵育10 min，BSA封閉15 min，加入CD14一抗4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫1 h，加入二抗室溫孵育15 min，DAB顯色后脫水，透明，中性樹膠封片。CD14位于腎細(xì)胞胞質(zhì)中，以呈棕黃色為陽性。在200倍顯微鏡下隨機(jī)采集腎臟皮質(zhì)區(qū)10個視野，采用Image pro plus6.0軟件測量腎小球及腎小管CD14陽性細(xì)胞的累積光密度(IOD)值，作為CD14的相對表達(dá)量。

1.3.5 腎組織NF-κB、ICAM-1及GLP-1R蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。取腎組織加入RIPA裂解液和PMSF后充分勻漿研磨，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，測定蛋白濃度，采用PBS配平各組蛋白。配制10%分離膠，采用SDS-PAGE電泳儀在恒壓65 V下電泳1 h，再恒壓110 V、2 h，半干轉(zhuǎn)膜，BSA封閉2 h；分別加入NF-κB、ICAM-1及GLP-1R一抗4 ℃孵育過夜；TBST洗膜10 min×3次，加入二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜10 min×3次，BCIP/NBT試劑盒顯色；采用Image J分析NF-κB、ICAM-1及GLP-1R蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 尿白蛋白/肌酐、體質(zhì)量和血清HbA1c水平 與對照組和利拉魯肽組比較，模型組和觀察組體質(zhì)量減低、血清HbA1c水平及尿白蛋白/肌酐升高(P均<0.01)，且觀察組尿白蛋白/肌酐低于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組尿白蛋白/肌酐、體質(zhì)量和血清HbA1c水平比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與利拉魯肽組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.2 血清TNF-α、1L-6、IL-1β水平 模型組血清TNF-α、1L-6、IL-1β水平均明顯高于對照組和利拉魯肽組(P均<0.05)，觀察組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、1L-6、IL-1β水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與利拉魯肽組比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.01。

2.3 腎組織形態(tài)改變 光鏡下觀察到對照組和利拉魯肽組腎小球及腎小管大小正常、形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，腎小球及腎小管中銀染顆粒較少；模型組腎小球體積增大，腎小球及腎小管細(xì)胞數(shù)目增多，可見腎小管上皮細(xì)胞變性，部分腎小管管腔輕度擴(kuò)張、上皮細(xì)胞萎縮、毛細(xì)血管狹窄，部分甚至閉塞，腎小球和腎小管中可見大量銀染顆粒；與模型組比較，觀察組腎小管和腎小球損傷明顯減輕，腎組織細(xì)胞數(shù)量下降，銀染顆粒明顯減少。見插頁Ⅰ圖2、3。

2.4 腎組織CD14表達(dá) 模型組腎組織CD14表達(dá)明顯高于對照組、利拉魯肽組(P均<0.01)，觀察組明顯低于模型組(P<0.01)。見表3。

表3 各組腎小球和腎小管CD14表達(dá)比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與利拉魯肽組比較，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.5 腎組織NF-κB、ICAM-1及GLP-1R蛋白表達(dá) 與對照組和利拉魯肽組比較，模型組腎組織NF-κB、ICAM-1蛋白相對表達(dá)量升高，GLP-1R蛋白相對表達(dá)量降低；與模型組比較，觀察組腎組織NF-κB、ICAM-1蛋白相對表達(dá)量減低，GLP-1R蛋白相對表達(dá)量升高；組間比較P均<0.05。見表4。

表4 各組腎組織NF-κB、ICAM-1及GLP-1R蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與利拉魯肽組比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

早期DKD病理學(xué)改變主要為腎臟肥大、腎小管和腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)進(jìn)行性積聚，最終導(dǎo)致結(jié)節(jié)性或節(jié)段性腎小球硬化。高血糖作為糖尿病最基本的病因可直接損傷腎臟，也可通過炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子、晚期糖基化終末產(chǎn)物堆積等多種途徑進(jìn)一步促進(jìn)DKD的發(fā)生、發(fā)展[8]。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠血清HbA1c水平較對照組顯著升高，體質(zhì)量明顯減輕，尿白蛋白及肌酐排泄增多；經(jīng)過利拉魯肽腹腔連續(xù)注射8周，尿蛋白及肌酐水平顯著下降，但血清HbA1c及體質(zhì)量無明顯改變；此外，本研究HE及六胺銀染色發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎小球體積增大、結(jié)構(gòu)模糊，腎小球、腎小管細(xì)胞明顯增多，毛細(xì)血管上皮細(xì)胞排列紊亂且腫脹，可見毛細(xì)血管管腔狹窄，基底膜顯著增厚，腎小管呈空泡樣變性，而觀察組腎組織病理改變較模型組明顯好轉(zhuǎn)；提示利拉魯肽對糖尿病大鼠腎組織損傷具有一定保護(hù)作用，且不依賴于血糖及體質(zhì)量的降低。

近年研究表明，腎臟炎癥反應(yīng)在糖尿病腎病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，代謝及血流動力學(xué)紊亂等多種因素均可激活炎癥反應(yīng)[9,10]。炎性環(huán)境下ECM可由腎小球系膜細(xì)胞異常分泌增多，積聚在腎小球內(nèi)，使腎毛細(xì)血管狹窄，甚至閉塞，進(jìn)一步導(dǎo)致彌漫性或結(jié)節(jié)性腎小球硬化。巨噬細(xì)胞是糖尿病腎病中調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞，其活化后可大量釋放促纖維化因子、促炎因子等[11]。CD14主要分布于單核-巨噬細(xì)胞表面，可作為大鼠腎臟單核-巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志物，通過與脂多糖結(jié)合蛋白特異性結(jié)合啟動單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致系膜細(xì)胞合成ECM增加并使之在腎小球沉積，促進(jìn)系膜擴(kuò)張、基底膜增厚；同時CD14還促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，抑制ECM降解酶合成，從而促進(jìn)腎小球硬化[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組腎組織CD14表達(dá)明顯高于對照組，利拉魯肽治療后CD14表達(dá)被抑制，提示利拉魯肽可能通過抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮預(yù)防和治療糖尿病腎病的作用。

已有研究證實(shí)，高血糖可直接刺激腎小球系膜細(xì)胞增生、分泌炎性介質(zhì)、介導(dǎo)腎臟炎癥損傷，還可以通過刺激單核-巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，使炎癥因子、趨化因子、細(xì)胞黏附因子等表達(dá)增加，釋放前炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、1L-6、IL-1β、趨化因子、致纖維化因子TGF-β等，進(jìn)一步促進(jìn)腎臟固有細(xì)胞炎癥損傷，使NF-κB與其抑制蛋白I-κB解離進(jìn)入到細(xì)胞中，從而正反饋促進(jìn)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步擴(kuò)大[13]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，正常情況下呈低表達(dá)，高血糖刺激NF-κB活化后，與ICAM-1結(jié)合，并使其轉(zhuǎn)錄增加，刺激炎癥細(xì)胞浸潤并黏附于血管內(nèi)皮，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎性損傷，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化[14]。Okada等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1基因敲除的db小鼠腎組織中巨噬細(xì)胞浸潤減少、ECM積聚抑制，導(dǎo)致尿蛋白排出明顯減低。本研究糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞核中NF-κB明顯增多，TNF-α、1L-6、IL-1β分泌增多；利拉魯肽治療后NF-κB表達(dá)減低，炎癥相關(guān)因子分泌降低；說明利拉魯肽可能通過抑制NF-κB表達(dá)減弱炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，利拉魯肽可抑制糖尿病大鼠腎損害；抑制NF-κB活化后介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、促進(jìn)GLP-1R分泌可能是其作用機(jī)制。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200595/81400807)；江蘇省衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目(H201253/H201554)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(WSN-101)。

張紅(E-mail: zhh79318@163.com)；李偉(E-mail: liwei.190@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.008

R587.1

A

1002-266X(2016)44-0027-04

2016-03-02)