閆益波，李文剛，焦福林，吳志娟，胡廣英，周勝花，隋 朝，岳 磊，任毅菲

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

豬卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及細(xì)胞生物學(xué)特性研究

閆益波，李文剛，焦福林，吳志娟，胡廣英，周勝花，隋 朝，岳 磊，任毅菲

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

顆粒細(xì)胞是研究雌性動物生殖生理、病理、藥理和毒理機(jī)制的重要細(xì)胞模型。采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的方法，建立豬卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)并研究其生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，抽吸法和剖切法分離豬卵巢顆粒細(xì)胞各有利弊，但都對細(xì)胞的活率影響不顯著；有血清的培養(yǎng)效果好于無血清，而且以胎牛血清的效果較好，基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM和TCM199的培養(yǎng)效果相似，以DMEM＋10%FBS培養(yǎng)效果最好；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)了顆粒細(xì)胞貼壁生長和缺乏接觸抑制的現(xiàn)象，體外生長曲線符合貼壁細(xì)胞的生長特征，DAPI熒光染色法沒有檢測到支原體污染，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。

豬；顆粒細(xì)胞；分離；細(xì)胞培養(yǎng)

顆粒細(xì)胞是卵泡發(fā)育和閉鎖過程中最重要的體細(xì)胞，在卵泡局部微環(huán)境調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。早期研究表明，卵泡閉鎖的實質(zhì)是顆粒細(xì)胞的凋亡[1-3]，只有充分認(rèn)識了顆粒細(xì)胞的生物學(xué)特性，才可以進(jìn)一步認(rèn)識卵泡和卵子的發(fā)育規(guī)律。豬作為多胎哺乳動物，每個生殖周期有多個卵泡發(fā)育成熟并排卵，是研究雌性哺乳動物卵泡發(fā)育的良好動物模型，建立適宜的豬卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)體系不僅為豬卵巢生物學(xué)研究建立了體外技術(shù)平臺，同時為豬卵巢生殖毒理學(xué)研究提供細(xì)胞試驗?zāi)Ｐ蚚4-5]。

本研究通過建立適宜的豬卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)系統(tǒng)，為體外研究豬卵巢生理、病理、藥理和毒理機(jī)制提供研究平臺。

1 材料和方法

1.1 試劑與設(shè)備

TCM199培養(yǎng)液（T），DMEM培養(yǎng)液（D），胎牛血清（FBS），新生牛血清（NCS），超凈工作臺，胰蛋白酶，PBS，DAPI，青霉素，鏈霉素，谷氨酰胺，倒置顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱，離心機(jī)等。

1.2 顆粒細(xì)胞的分離

采集母豬卵巢，用含雙抗的滅菌生理鹽水沖洗5次，洗凈卵巢上的血污，裝入大燒杯并用37℃左右的滅菌生理鹽水淹沒后帶入無菌室。在無菌操作室，放在37℃的水浴鍋里保溫采集卵巢顆粒細(xì)胞。分別使用抽吸法和剖切法分離豬卵巢顆粒細(xì)胞。

抽吸法：將清理后的卵巢置于滅菌培養(yǎng)皿中，用帶18號針頭的一次性注射器抽吸卵巢表面直徑2～6 mm和大于6 mm的卵泡中的卵泡液，抽取的卵泡液用洗卵液稀釋后，靜置5～10 min，在光鏡下使用拉制好的玻璃吸管除去卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，剩余脫落顆粒細(xì)胞反復(fù)吹打后，吸取全部卵泡液和顆粒細(xì)胞，置于離心管內(nèi)以2 000 r/min離心5 min，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸計數(shù)后體外培養(yǎng)。

剖切法：將卵巢置于培養(yǎng)皿中，然后用手術(shù)刀片對卵巢皮質(zhì)進(jìn)行縱橫方向1～2 mm間距的切割，然后用PBS反復(fù)沖洗，將沖洗液靜置5～10 min，倒出上層清液，然后在光鏡下使用拉制好的玻璃吸管除去卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，剩余脫落顆粒細(xì)胞反復(fù)吹打后，吸取全部卵泡液和顆粒細(xì)胞，置于離心管內(nèi)以2 000 r/min離心5 min，細(xì)胞培養(yǎng)液重懸計數(shù)后體外培養(yǎng)。

1.3 臺盼蘭排斥實驗檢測細(xì)胞活率

用離心管收集顆粒細(xì)胞，加入胰蛋白酶并輔助機(jī)械吹打的方式使分散，PBS洗2遍后，調(diào)節(jié)細(xì)胞為適當(dāng)密度（1×105個/mL）左右，與0.04%的臺盼蘭以1∶2的比例混勻，染色1 min后用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，其中，細(xì)胞全部呈藍(lán)色的為死亡細(xì)胞，細(xì)胞中間透明不著色的為活細(xì)胞，細(xì)胞的存活率＝活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)＋死亡細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4 基礎(chǔ)培養(yǎng)基與血清對顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的效果

設(shè)計6種組成培養(yǎng)基，接種后24，48 h在光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的生長狀態(tài)。

6組培養(yǎng)基分別為：T.TCM199＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素；T＋10%FBS. TCM199＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素＋10%FBS；T＋10%NCS.TCM199＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100IU/mL青鏈霉素＋10%NCS；D.DMEM（高糖）＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素；D＋10%FBS.DMEM（高糖）＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素＋10%FBS；D＋10% NCS.DMEM（高糖）＋100 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/ mL青鏈霉素＋10%NCS。

1.5 豬顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

分離出顆粒細(xì)胞后，使用細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM（高糖）＋10%FBS＋2 mmol/L谷氨酰胺＋100 IU/mL青鏈霉素）調(diào)整細(xì)胞密度到1×106個/mL，每孔1 mL接種于 24孔培養(yǎng)板中，在 37℃，5% CO2，95%空氣，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0，24，48 h觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.6 支原體檢測分析

吸除顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗干凈，加入終濃度為50 μg/mL的DAPI熒光染色液，37℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中染色30 min，去除處理液，PBS沖洗3～5次，去除未結(jié)合的DAPI，熒光顯微鏡下觀察。

1.7 顆粒細(xì)胞的生長曲線

選取第3代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，按照2× 104個/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔接種1 mL。從接種時間算起，每隔24 h計數(shù)3孔內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值，共計7 d。以培養(yǎng)時間（d）為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作生長曲線。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬顆粒細(xì)胞的分離

結(jié)果顯示，抽吸法和剖切法在分離每個卵巢顆粒細(xì)胞的時間上差異顯著（P＜0.05），但是在所得顆粒細(xì)胞的活率上差異不顯著（P＞0.05）（表1）。

表1 不同分離方法對分離顆粒細(xì)胞的影響

2.2 不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清對豬卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

結(jié)果顯示，基礎(chǔ)培養(yǎng)培養(yǎng)基TCM199與DMEM培養(yǎng)效果基本相同，有血清培養(yǎng)系統(tǒng)比無血清培養(yǎng)系統(tǒng)中顆粒細(xì)胞的貼壁速度快、大小均勻、生長狀態(tài)好，添加10%FBS的培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長狀態(tài)較好，尤其是D＋10%FBS培養(yǎng)效果最佳（表2）。

表2 不同培養(yǎng)基對豬卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)的影響

2.3 豬顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

結(jié)果顯示，懸浮在培養(yǎng)液中的顆粒細(xì)胞呈小圓球狀，也有的形狀不太規(guī)則（圖1-A）；培養(yǎng)12 h后部分顆粒細(xì)胞貼壁，未開始伸展（圖1-B）；培養(yǎng)24 h后豬顆粒細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則狀貼壁生長（圖1-C）。顆粒細(xì)胞生長缺乏接觸性抑制，可形成聚集物或呈丘陵樣生長。

2.4 傳代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞支原體污染分析

結(jié)果顯示，傳第3代的豬顆粒細(xì)胞與熒光染料DAPI染色后，只觀察到細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，在細(xì)胞核和細(xì)胞膜之間看不到熒光，表明培養(yǎng)細(xì)胞沒有發(fā)生支原體污染（圖2）。

2.5 顆粒細(xì)胞的體外生長曲線

結(jié)果顯示，接種2 d后細(xì)胞數(shù)量開始明顯增加，第2～4天為對數(shù)生長期，第5～7天進(jìn)入平臺期。體外培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)出“潛伏期—對數(shù)生長期—停滯期”的生長模式（圖3）。

3 討論

豬繁殖力高，且由于其來源方便、結(jié)構(gòu)和生理與人類的相似及其在畜牧業(yè)中的重要地位等諸多優(yōu)勢，使得豬卵巢顆粒細(xì)胞成為重要的細(xì)胞模型，相應(yīng)的研究結(jié)果可以為人類生殖生理、病理、藥理和毒理研究提供良好的試驗基礎(chǔ)和借鑒，因此，建立完善的豬卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)系統(tǒng)非常重要。目前，豬卵巢顆粒細(xì)胞的分離主要有剖切法[6]和抽吸法[7]，分離效果還未有定論。本研究發(fā)現(xiàn)，在分離時間上剖切法顯著好于抽吸法，獲得細(xì)胞數(shù)量相對較大，但是二者獲得顆粒細(xì)胞的活率差異不顯著，表明2種方法各有優(yōu)勢，如果試驗所需顆粒細(xì)胞數(shù)量大，可用剖切法，否則抽吸法比較簡單高效。

豬顆粒細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基主要有DMEM[8]，DMEM/F12[9]，TCM199[10-11]和McCoy's 5A[12]等，其中最常見的是DMEM和TCM199，然而適宜豬卵巢顆粒細(xì)胞體外長期培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基還有待于進(jìn)一步優(yōu)選。另外，血清對體外培養(yǎng)的多種細(xì)胞的生長、增殖起重要的作用，而牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基，也是應(yīng)用最為廣泛的血清制品。本研究表明，單獨(dú)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，DMEM和TCM199培養(yǎng)效果都較差，添加血清是必要的，可明顯改善2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的效果，而且以DMEM和10%胎牛血清的互作效果最好。本研究血清的添加量以常用體細(xì)胞培養(yǎng)的10%添加，是否是最佳劑量還有待進(jìn)一步研究。

懸浮狀態(tài)的豬顆粒細(xì)胞成明亮的球形，12 h后開始貼壁生長，24 h后呈梭形或不規(guī)則形狀貼壁生長，研究發(fā)現(xiàn)，部分顆粒細(xì)胞生長缺乏接觸性抑制，呈現(xiàn)丘陵樣集落生長，這與孫晉艷等[7]的研究結(jié)果相似。體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程一般分為潛伏期、對數(shù)生長期和停滯期，本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞存在早期生長延緩和晚期生長抑制的現(xiàn)象，符合貼壁細(xì)胞的一般生長規(guī)律，生長狀態(tài)良好，生長曲線顯示，顆粒細(xì)胞的對數(shù)生長期大約在第2～4天，這與朱麗等[6，13]的結(jié)果相似。

一般來講，由于環(huán)境條件限制或操作不嚴(yán)格，許多細(xì)胞系都存在支原體污染現(xiàn)象，導(dǎo)致傳代細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞形態(tài)不典型、空泡化和脂滴化等問題。顆粒細(xì)胞從卵巢采集到細(xì)胞分離進(jìn)入培養(yǎng)箱，操作過程時間長、步驟多，很容易受到污染，尤其是光鏡下難以發(fā)現(xiàn)的支原體污染。支原體是介于細(xì)菌和病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，是體外細(xì)胞培養(yǎng)中最常見且不易察覺的污染物[14]，污染物高達(dá)30%～60%[15]。常見的檢測方法是DNA熒光染色法和培養(yǎng)法[16]。本研究顯示，傳代培養(yǎng)的豬顆粒細(xì)胞只觀察到細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光，在細(xì)胞核和細(xì)胞膜之間看不到熒光，表明培養(yǎng)細(xì)胞沒有發(fā)生支原體污染，驗證了培養(yǎng)條件的安全可靠。

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Isolation，Culture and Biological Characteristics of Porcine Ovarian Granulosa Cells

YANYibo，LI Wengang，JIAOFulin，WUZhijuan，HUGuangying，ZHOUShenghua，SUI Chao，YUE Lei，RENYifei
（Institute ofAnimal Husbandry&Veterinary，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

Ovarian granulosa cells is an important cell model to study the mechanism of reproductive physiology,pathology, pharmacology and toxicology of female animals.The research adopted the method of conventional cell culture to establish the porcine ovarian granulosa cell culture system and study its biological characteristics.The results showed that suction method and split method each had their pros and cons,both had no significant effect on cell viability.The effect of serum was better than that of serum-free,and the effect offetal bovine serumwas better.The culture effect ofDMEMand TCM199 was similar,and the effect ofDMEM＋10%FBS was the best.Morphological observation showed that granulosa cells had the characteristics of adherent growth and lack of contact inhibition, the growth curve in vitro was consistent with the growth characteristics of adherent cells,DAPI fluorescence staining method did not detect mycoplasma contamination,the porcine ovarian granulosa cell grewwell.

pig;ovarian granulosa cells;isolation;cell culture

S828

A

1002-2481（2016）06-0825-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.26

2016-02-17

山西省自然科學(xué)基金項目（2013011029-4）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士研究基金項目（YBSJJ1201）

閆益波（1979-），男，山西臨猗人，副研究員，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖學(xué)研究工作。李文剛為通信作者。