郝輝芳，范月仙，李生泉，孫亞莉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801）

12℃低溫鍛煉對(duì)棉苗抗冷性的影響

郝輝芳1，范月仙2，李生泉2，孫亞莉1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西太谷030801）

棉花苗期的抗冷性直接影響棉花生產(chǎn)，抗冷性是棉花育種的一項(xiàng)重要指標(biāo)。通過棉苗抗氧化酶活性和可溶性蛋白含量的變化來分析12℃低溫鍛煉棉苗后，其耐4℃冷脅迫能力。將棉種脫絨后浸泡適當(dāng)時(shí)間，于28℃/ 12 h光照條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出至少2片真葉后，分為2組：一組作為對(duì)照（未低溫鍛煉），另一組于12℃/12 h光照條件下低溫鍛煉5 d，然后2組一起于4℃/12 h光照條件下冷脅迫5 d后，取真葉進(jìn)行研究。結(jié)果表明，晉棉35號(hào)、晉棉44號(hào)、晉棉49號(hào)這3種供試棉種經(jīng)過12℃鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫過程中基本都表現(xiàn)出SOD，CAT，POD活性以及可溶性蛋白含量明顯高于同期未經(jīng)低溫鍛煉的棉苗，說明經(jīng)過12℃臨界低溫鍛煉5 d后的棉苗耐4℃冷脅迫能力有所提高。

低溫鍛煉；棉苗；抗氧化酶活性；可溶性蛋白含量

棉花苗期的抗冷性嚴(yán)重影響著棉花的產(chǎn)量和質(zhì)量，適當(dāng)?shù)牡蜏劐憻捒梢蕴岣咧参锏目估湫訹1-5]。植物在可耐受的低溫環(huán)境中不但不會(huì)受到低溫傷害，還能積極啟動(dòng)防御機(jī)制，一方面通過抗氧化系統(tǒng)（超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）及時(shí)清除過剩的氧自由基[6-7]；另一方面通過可溶性物質(zhì)如可溶性蛋白的積累調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，減少水分流失，從而保護(hù)核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能完整[8-9]，進(jìn)而提高自身的抗冷性。

本研究擬通過抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性和可溶性蛋白質(zhì)含量的變化來分析低溫鍛煉后棉苗耐冷脅迫的能力，進(jìn)一步分析棉花的抗冷機(jī)制，旨在為抗冷性棉花的選育提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）晉棉35號(hào)、晉棉44號(hào)、晉棉49號(hào)，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2 方法

挑選飽滿棉種經(jīng)濃硫酸脫絨后，置于水中28℃過夜浸泡，使其春化。將春化好的種子播種于營養(yǎng)缽中（土∶沙＝3∶1），并做好標(biāo)記。28℃/12 h光照條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出至少2片真葉后分為2組，其中一組不進(jìn)行低溫鍛煉，作為對(duì)照，另一組轉(zhuǎn)入12℃/12 h光照條件下恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行低溫鍛煉5 d，然后再與對(duì)照一起置于4℃/12 h光照環(huán)境中分別進(jìn)行冷脅迫0，1，3，5 d。分別采摘經(jīng)冷脅迫不同天數(shù)的棉花真葉進(jìn)行測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

準(zhǔn)確稱取新鮮棉花真葉0.2 g置于預(yù)冷研缽中，加入2 mL0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH值7.8），冰浴研磨成勻漿，10 000 r/min，4℃下離心15 min，取上清液用于酶活性測(cè)定[10]。采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性，采用過氧化氫法測(cè)定CAT活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性。

準(zhǔn)確稱取0.2 g棉花真葉，放入預(yù)冷的1.5 mL EP管中，加入1 mL蛋白提取液[11]后用研杵研碎，于4℃，12 000 r/min離心15 min，吸取上清；再重復(fù)一次離心，取上清進(jìn)行測(cè)定。參照劉艷玲[12]的方法繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SAS 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同數(shù)據(jù)組間的差異采用單因素進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花真葉中3種保護(hù)酶活性變化及分析

由表1可知，3個(gè)品種的棉花經(jīng)過12℃低溫鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫3 d時(shí)，SOD，CAT，POD這3種保護(hù)酶活性都明顯高于同期對(duì)照。

表1 3個(gè)品種棉花中3種保護(hù)酶活性變化 U/（g·min）

晉棉35號(hào)未經(jīng)12℃低溫鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫過程中，SOD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先上升后持續(xù)下降，到冷脅迫5 d時(shí)與未經(jīng)冷脅迫間差異極顯著（P＜0.01）；CAT活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先上升后下降，冷脅迫3 d時(shí)就顯著低于未經(jīng)冷脅迫處理；POD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，冷脅迫3 d時(shí)就顯著低于未經(jīng)冷脅迫處理，到冷脅迫5 d時(shí)降低到原來的75.4%。而經(jīng)過12℃低溫鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫過程中，SOD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先上升后下降再回升，且與同期未經(jīng)低溫鍛煉的對(duì)照相比，在冷脅迫3 d差異達(dá)極顯著水平（P＜0.01），冷脅迫5 d是同期未經(jīng)鍛煉的1.14倍；CAT活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，并且明顯高于同期未經(jīng)鍛煉處理，冷脅迫1 d與未經(jīng)鍛煉處理間差異極顯著，冷脅迫5 d時(shí)是同期未經(jīng)低溫鍛煉的5.57倍；POD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，冷脅迫1 d與未經(jīng)鍛煉處理間差異不顯著，冷脅迫3 d時(shí)與未經(jīng)鍛煉處理間差異極顯著，到冷脅迫5 d時(shí)是同期對(duì)照的1.38倍。

晉棉44號(hào)未經(jīng)12℃低溫鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫過程中，SOD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，冷脅迫5 d時(shí)下降更為明顯，與未脅迫處理間差異極顯著（P＜0.01）；CAT活性在冷脅迫1 d時(shí)上升，后隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，冷脅迫5 d時(shí)下降到原來的58.6%；POD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)也是先明顯上升后下降，冷脅迫5 d時(shí)降到原來水平，與未脅迫處理間差異不顯著。而經(jīng)過12℃低溫鍛煉的在4℃冷脅迫過程中，SOD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先下降再回升，冷脅迫5 d時(shí)比未脅迫的還要高2.75%，且都明顯高于同期對(duì)照，冷脅迫5 d時(shí)是同期對(duì)照的1.17倍；CAT活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，冷脅迫3 d后與未脅迫處理間差異極顯著，且也都明顯高于同期對(duì)照，二者差異在脅迫1 d就達(dá)顯著水平（P＜0.05），3，5 d達(dá)極顯著差異水平（P＜0.01）；POD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先下降后回升，到冷脅迫1 d后與未脅迫處理間差異極顯著，且在脅迫過程中一直明顯高于同期對(duì)照，差異極顯著（P＜0.01）。

晉棉49號(hào)未經(jīng)12℃低溫鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫過程中，SOD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，冷脅迫1 d時(shí)就與未冷脅迫處理間差異極顯著（P＜0.01）；CAT活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先上升后持續(xù)下降，冷脅迫3 d時(shí)與未冷脅迫處理間差異極顯著（P＜0.01）；POD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)也是先下降后回升再下降，冷脅迫1～3 d時(shí)與未冷脅迫處理間差異不顯著，到5 d時(shí)差異極顯著（P＜0.01）。而經(jīng)過12℃低溫鍛煉的在4℃冷脅迫過程中，SOD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先下降再回升，冷脅迫5 d時(shí)回升到原來水平，未冷脅迫時(shí)與未鍛煉處理間差異不顯著，冷脅迫1～5 d都明顯高于同期對(duì)照；CAT活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)上升，冷脅迫1 d后與未冷脅迫處理間差異顯著（P＜0.05），且也都明顯高于同期對(duì)照，且差異極顯著（P＜0.01）；POD活性隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，到冷脅迫5 d后與未脅迫處理間差異極顯著，且在脅迫過程中一直明顯高于同期對(duì)照，且差異都極顯著（P＜0.01）。

SOD，CAT，POD都屬于保護(hù)酶系統(tǒng)[13]，在低溫逆境中可以協(xié)同作用，有效地清除活性氧，盡可能地維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，有效地抵御外界逆境的傷害，從而提高植物的抗逆性。胡建芳等[14]研究認(rèn)為，保護(hù)酶活性是反映植物抗寒能力的重要指標(biāo)，耐寒性強(qiáng)的品種能維持較高的酶活性。本研究結(jié)果表明，晉棉35號(hào)、晉棉44號(hào)、晉棉49號(hào)經(jīng)過12℃低溫鍛煉5 d后，在4℃冷脅迫過程（1～5 d）中都表現(xiàn)出了SOD，CAT活性明顯高于未經(jīng)鍛煉處理；POD活性在4℃冷脅迫3 d后明顯高于未經(jīng)鍛煉處理，說明12℃低溫鍛煉5 d后，3種供試棉耐4℃冷脅迫能力都有所提高。

2.2 棉花真葉中可溶性蛋白含量變化及分析

從圖1可以看出，晉棉35號(hào)、晉棉44號(hào)、晉棉49號(hào)3個(gè)品種未經(jīng)12℃低溫鍛煉5 d的在4℃冷脅迫過程中，可溶性蛋白含量都隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低；而經(jīng)過12℃低溫鍛煉處理都隨冷脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先降低再回升后又降低，冷脅迫初期（1 d），與未低溫鍛煉處理間差異不顯著，在冷脅迫3 d時(shí)，含量達(dá)到最高，與同期對(duì)照相比差異顯著，冷脅迫5 d時(shí)，差異也顯著。

可溶性蛋白是細(xì)胞內(nèi)多種非膜結(jié)合蛋白的組合，一般游離存在于細(xì)胞中，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓起一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，低溫環(huán)境中，植物會(huì)調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與分解，利用一些已有蛋白質(zhì)或新合成一些蛋白質(zhì)來維持正常溫度下才能進(jìn)行的新陳代謝。陳禪友等[16]研究認(rèn)為，可溶性蛋白含量變化與植物的抗寒性有關(guān)，其積累可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑而利于作物抗寒。本研究中，12℃低溫鍛煉5 d后在4℃冷脅迫過程中，3個(gè)品種的棉苗真葉中可溶性蛋白含量都明顯高于同期未經(jīng)鍛煉處理，說明12℃低溫鍛煉5 d后，棉苗的耐4℃冷脅迫能力有所提高。

3 討論與結(jié)論

植物處于逆境時(shí)，會(huì)迅速產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基會(huì)轉(zhuǎn)化成H2O2，進(jìn)一步生成脂質(zhì)自由基和蛋白自由基，破壞細(xì)胞脂類和蛋白結(jié)構(gòu)變化，從而影響細(xì)胞的正常功能代謝[17]。在剛處于低溫環(huán)境時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基會(huì)由SOD最先發(fā)生作用迅速清除，但未及時(shí)清除的氧自由基就會(huì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成H2O2，再由CAT和POD發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明，12℃低溫鍛煉5 d后在4℃冷脅迫過程中，棉苗真葉中SOD，CAT，POD這3種保護(hù)酶活性都表現(xiàn)出明顯高于未經(jīng)鍛煉處理，而酶活性的高低與植物的抗寒性密切相關(guān)，說明12℃低溫鍛煉5 d對(duì)棉苗的耐4℃冷脅迫能力確實(shí)有所作用?？扇苄缘鞍讓?duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓可起一定的作用?？扇苄缘鞍椎姆e累可作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和防脫水劑而利于作物抗寒。本研究結(jié)果表明，12℃低溫鍛煉5 d后在4℃冷脅迫過程中，3個(gè)品種的棉苗真葉中可溶性蛋白含量都明顯高于同期未經(jīng)鍛煉處理，說明12℃低溫鍛煉5 d后，棉苗的耐4℃冷脅迫能力確實(shí)有所提高。

綜上所述，12℃低溫鍛煉5 d，能有效提高棉花幼苗的保護(hù)酶活性、增加可溶性蛋白含量，從而有效提高棉苗的耐4℃冷脅迫能力。

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Effect of 12℃Low Temperature Exercise on Cold Resistance of Cotton Seedlings

HAOHuifang1，F(xiàn)ANYuexian2，LI Shengquan2，SUNYali1
（1.College ofInformation，Shanxi Agricultural University，Taigu 030800，China；2.College ofArts and Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Cold resistance on stage of cotton seedling is directly related to production and it is also an important indicator of the cotton breeding.This studydetected the change ofantioxidant enzyme activityand the content ofsoluble protein ofcotton seedlings，under the condition of cold resistance at 4℃after cold acclimating at 12℃.Detinted cotton seeds and soaked for an appropriate time,then cultured at 28℃/12 h,until it grewat least two true leaves.Leaving the control（without cold acclimating）,the remain were created at 12℃/12 h acclimating for 5 days.Then all placed at 4℃/12 h cold stressing for 5 days,then determinated the indicators of euphylla. The results showed that after exercising at 12℃for 5 days,in the 4℃cold stress process,Jinmian 35,Jinmian 44,Jinmian 49 all showed SOD,CAT,POD activity obviously higher than that of without exercising,and the soluble protein content also showed obviously higher than that ofthe control.It indicated that cold resistance ofcotton seedlings at 4℃improved after at 12℃critical cold acclimating for 5 days.

cold acclimation;cotton seedlings;antioxidant enzyme activity;soluble protein content

S562

A

1002-2481（2016）06-0726-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.06.02

2016-03-29

郝輝芳（1985-），女，山西平遙人，助教，碩士，主要從事植物抗性相關(guān)研究工作。