張李琦，鄭明學，蘇曉晴，吉明霞，史晨婕，白瑞，貢鑫，席柔，張黎，徐之勇

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

替米考星明膠微囊含量測定方法研究

張李琦，鄭明學，蘇曉晴，吉明霞，史晨婕，白瑞，貢鑫，席柔，張黎，徐之勇

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

為了建立起科學、準確的替米考星明膠微囊含量測定方法，試驗分別建立了紫外分光光度法（UV）及高效液相色譜法（HPLC）2種方法，同時對2種分析方法的專屬性、線性、準確度、精密度進行比較驗證。結果表明，UV測得替米考星對照品與替米考星微囊均在（291±1）nm波長處有最大吸收峰，且HPLC測得二者的順反異構體的保留時間基本一致，2種方法輔料均無干擾；線性關系試驗中，替米考星對照品溶液在質量濃度為30.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)，2種方法均表現(xiàn)出良好的線性關系，且R2紫外＝0.999 4＜R2液相＝0.999 5；準確度試驗中，2種方法的平均回收率均在98.0%～102.0%，RSD均小于2%，但紫外法測得質量濃度45 μg/mL的供試品平均回收率為97.98%，沒有達到規(guī)定要求；精密度試驗中，2種方法的RSD均小于2%。因此，UV法與HPLC法都基本滿足測定替米考星明膠微囊含量的要求，而采用HPLC法測定則更為準確，其可以用作對替米考星明膠微囊進行質量控制的測定方法。

替米考星明膠微囊；含量測定；高效液相色譜法；紫外分光光度法

替米考星是由英國Elanco公司于20世紀80年代開發(fā)研制的一種畜禽專用抗生素，其對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌活性的抑制顯著，同時對多種螺旋體和支原體的生長具有較強的抑制作用[1-2]。替米考星明膠微囊是山西農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)病理實驗室以B型明膠為囊材、替米考星為芯材，通過單凝聚法制備而成。目前，測量替米考星含量最常用的分析方法有HPLC法和UV法；而用于替米考星明膠微囊含量測定的分析方法國內(nèi)外尚未見報道。

本試驗分別建立了UV法和HPLC法2種測定方法，且依據(jù)《獸用化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則》[3]和《中華人民共和國獸藥典》[4]中相關規(guī)定對2種方法的專屬性、線性、準確度、精密度等進行方法學驗證，并對所采用分析方法的科學性、準確性和可行性進行驗證，以比較分析方法是否符合測試項目的目的和要求，從而建立替米考星明膠微囊的測定方法，以保證所用的分析方法確實能夠用于替米考星明膠微囊的質量控制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑替米考星對照品（含量99.8%），北京索萊寶科技有限公司（ST9180）；替米考星原料藥（含量99%），寧夏泰瑞制藥股份有限公司（G8141235）；替米考星明膠微囊，山西農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)病理實驗室自制（201512）；胰酶，北京索萊寶科技有限公司（T8150）；四氫呋喃（色譜純），天津市光復精細化工研究所（20150405）；二丁胺（色譜純），天津市光復精細化工研究所（20150302）；乙腈（色譜純），飛世爾實驗器材（上海）有限公司（A998-4）。1.1.2主要儀器UV-5200型紫外可見光分光光度計（上海元析儀器有限公司）；ThermoU3000高效液相色譜儀（戴安中國有限公司）。

1.2 試劑的配制

1.2.1 胰酶液的配制[4]其參照《中華人民共和國獸藥典》（2010版）進行。

1.2.2 UV法所需試劑的配制

1.2.2.1 替米考星對照品系列質量濃度的配制精密稱取實際含量50 mg的替米考星對照品，用0.1 mol/L的鹽酸溶液分別配制30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0 μg/mL系列濃度的替米考星對照品溶液[5]。

1.2.2.2 替米考星明膠微囊及空白明膠微囊溶液的配制[6-7]精密稱取經(jīng)研磨的替米考星明膠微囊0.1 g，置于100 mL燒杯中，加50 mL胰酶液，放于45℃超聲波清洗器內(nèi)超聲6 h，期間每隔0.5 h超聲（28 Hz，40 W）一次，每次15 min，于6 h后加入0.1 mol/L鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶內(nèi)，搖勻，用0.5 μm濾膜過濾，即得1 mg/mL的替米考星明膠微囊母液。用同樣方法配制空白明膠微囊溶液。

1.2.3HPLC法所需試劑的配制

1.2.3.1 磷酸稀釋液、磷酸二丁胺緩沖溶液配制其參照《中華人民共和國獸藥典》（2010版）進行[4]。

1.2.3.2 替米考星對照品系列濃度配制[15]其參照

1.2.2.1 替米考星對照品溶液的配制，注意改用磷酸稀釋液稀釋定容各濃度替米考星對照品溶液。

1.2.3.3 替米考星明膠微囊溶液的配制[9-10]參照

1.2.2.2 替米考星明膠微囊及空白明膠微囊溶液的配制，注意將0.1 mol/L鹽酸改用磷酸稀釋液稀釋，定容替米考星明膠微囊母液。用同樣方法配制空白明膠微囊溶液。

1.3 試驗方法

1.3.1 UV法專屬性測定取替米考星對照品溶液、替米考星明膠微囊溶液及空白明膠微囊溶液，利用紫外分光光度計在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，根據(jù)紫外吸收圖譜確定替米考星的最大吸收波長[11]。

1.3.2 UV法標準曲線的建立配制30.0，40.0，50.0，60.0，70.0，80.0，90.0 μg/mL的替米考星系列標準溶液，在確定的最大波長處測定對照品系列溶液的吸光度值（OD值），以對照品濃度（C）對OD值進行線性回歸，建立替米考星微囊含量測定的標準曲線方程，得出回歸方程、相關系數(shù)及線性圖[12-13]。

1.3.3 UV法測定的準確度取3份30 μg/mL的空白明膠微囊溶液于3個燒杯中，每份10 mL，分別添加10 mL質量濃度為30，60，90 μg/mL的替米考星標準溶液，最終制備成15，30，45 μg/mL這3個質量濃度的供試液，在最大波長處測定吸光度，重復3次。以空白明膠微囊為參比，計算3個不同添加質量濃度的回收率、平均回收率、相對標準偏差（RSD），各濃度下的平均回收率均應在98.0%～102.0%，9個回收率數(shù)據(jù)的RSD應不大于2.0%（表1）[14]。

1.3.4 UV法測定的精密度

1.3.4.1 重復性取同一批號的替米考星明膠微囊制成140，160，180 μg/mL這3種不同質量濃度供試品溶液，以空白微囊為參比，在最大波長處測定吸光度，重復測定3次，進行精密度測定，計算RSD，其RSD應不大于2%[14]。

1.3.4.2 中間精密度按照重復性試驗方法在另一時間換另一試驗員再進行一次試驗，計算出RSD，其RSD應不大于2%（表2）[14]。

1.3.5 HPLC法專屬性的測定色譜條件參考《中華人民共和國獸藥典》（2010版）[4]。精密量取10 μL替米考星對照品溶液和替米考星明膠微囊溶液、空白明膠微囊溶液進樣，記錄替米考星對照品溶液與替米考星明膠微囊溶液的保留時間是否相同，及空白明膠微囊溶液在此保留時間處有無吸收，并比較記錄替米考星色譜峰分離度，替米考星順反異構體分離度（R）不得小于2.0%[14-15]，且理論板數(shù)按替米考星順式峰計算，不低于3 000[4]。

1.3.6 HPLC法線性關系的測定配制同1.3.2替米考星對照品系列濃度溶液，進樣記錄色譜圖，對每個濃度樣品測定3次，以測得的峰面積（A）對被測樣品濃度進行線性回歸[16]。

1.3.7 HPLC法準確度的測定按照1.3.3方法制備15，30，45 μg/mL這3個質量濃度的供試液，各取10 μL進樣，記錄色譜圖。重復3次[17-18]，試驗結果評定標準同1.3.3[9-10]（表3）。

1.3.8 HPLC法測定的精密度[19]

1.3.8.1 重復性取同一批號的替米考星明膠微囊制成140，160，180 μg/mL這3種質量濃度供試品溶液，重復測定3次，每次取10 μL進樣，記錄色譜圖，計算RSD，其RSD應不大于2%[14-15]。

1.3.8.2 中間精密度按照重復性試驗方法在另一時間換另一試驗員再進行一次試驗，計算出RSD，其RSD應不大于2%（表4）[14-15]。

2 結果與分析

2.1 UV法專屬性試驗結果

由圖1可知，替米考星對照品與替米考星微囊在200～400 nm處紫外掃描的最大吸收波長相同，均為（291±1）nm；干擾輔料空白明膠微囊在（291± 1）nm處幾乎無吸收，可見，UV法測定的替米考星明膠微囊專屬性良好。

2.2 UV法建立標準曲線以對照品濃度（C）對OD（A）值進行線性回歸，得標準曲線方程為C＝41.322A－0.407 29（R2＝0.999 4），線性關系如圖2所示。由圖2可知，替米考星對照品在濃度在30.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3 UV法準確度測定結果

3種不同濃度的替米考星平均回收率為98.64%，其中，質量濃度為45 μg/mL的平均回收率不在98.0%～102.0%之內(nèi)，RSD＜2%，說明UV法準確度基本良好（表1）。

表1 UV法測定替米考星溶液準確度試驗結果

2.4UV法精密度測定結果

表2 UV法測不同濃度替米考星微囊溶液的精密度

UV法的重復性、中間精密度試驗中，RSD值均小于2%，符合要求，說明UV測替米考星含量精密度良好（表2）。

2.5 HPLC法專屬性試驗結果

從圖3可以看出，替米考星對照品與替米考星明膠微囊的順反異構體保留時間基本一致，并且空白明膠微囊在此保留時間內(nèi)沒有色譜峰；替米考星樣品的順反異構體分離度及塔板數(shù)符合要求；替米考星對照品的順反異構體分離度及其塔板數(shù)符合要求。表明HPLC法測替米考星明膠微囊專屬性良好。

2.6 HPLC法建立標準曲線

以測得的峰面積（M）作被測樣品濃度（C）的函數(shù)作圖進行線性回歸，得出標準曲線方程為C＝7.872 5M－1.055 8（R2＝0.999 5），線性關系如圖4所示。從圖4可以看出，替米考星對照品在30.0～90.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.7 HPLC測準確度結果

3種不同濃度的替米考星平均回收率為99.49%，RSD＜2%，說明HPLC法具有較高的準確度（表3）。

2.8 HPLC法精密度測定結果

HPLC法的重復性、中間精密度試驗中，RSD值均小于2%，符合要求，說明HPLC法測替米考星含量精密度良好（表4）。

表3 HPLC法測定替米考星溶液準確度試驗結果

表4 HPLC法測不同濃度替米考星微囊溶液的精密度

3 結論與討論

本試驗研究發(fā)現(xiàn)，UV法與HPLC法都基本滿足測定替米考星明膠微囊含量的要求，在準確度測定試驗中，HPLC法與UV法相比，HPLC法回收率更高，RSD較低，說明其準確度更高一些。宋艷紅等[5]在利用UV法測量替米考星含量的準確度試驗中得出，RSD為3.7%，不符合RSD值應不大于2%的要求；而閆春芝等[15]、張旭東等[8]在利用HPLC法測量替米考星含量的準確度試驗中得出，其準確度的各項指標均滿足要求。綜上可以看出，UV法準確度較差，HPLC法的準確度更為精準。

本試驗發(fā)現(xiàn)，在利用2種不同分析方法測量替米考星線性關系的試驗中得出，利用HPLC法測定替米考星標準曲線的線性關系比UV法測定的線性關系結果更好（R2紫外＝0.9994＜R2液相＝0.9995）。證明HPLC法的準確度要高于UV法。

有研究表明，UV法的專屬性不高，其主要誤差來源于共存物的譜線重疊而引起的光譜干擾；而HPLC法之所以有很高的準確度，是因為其常用的色譜柱具有很高的分離效能，可分離并分析高極性、高分子量和離子型等各種物質，柱效非常高，每米可達3萬塊以上，而且分析速度很快，具有高精度、高穩(wěn)定性的特點[20]。

綜上所述，UV法和HPLC法均可用于測定替米考星明膠微囊含量，但后者的準確度更高一些。

［1］農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.獸用化學藥物質量控制分析方法驗證技術指導原則（GPH5-1）[S].北京：中國獸藥監(jiān)察所，2009.

［2］Naccari F，Martino D.The rapeutic efficacy of tilmicosin in ovine mammaryinfections[J].Small Ruminant Research，2003，47：1-9.

［3］農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.獸用化學藥物質量標準建立的規(guī)范化過程技術指導原則（GPH1-1）[S].北京：中國獸藥監(jiān)察所，2010.

［4］中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

［5］宋艷紅，白小紅，李英.紫外分光光度法測定替米考星的含量[J].山西醫(yī)科大學學報，2005（1）：71-73.

［6］葛慶華，何雯.胰酶-超聲法測定甲氨蝶呤明膠微球的藥物含量[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1990，21（12）：553-557.

［7］張莎.緩釋型藥物載體明膠微球的制備及降解性能研究[D].西安：陜西科技大學，2010.

［8］張旭東，呂瑞娥，張寶國.替米考星的高效液相分析[J].鄭州大學學報：理學版，2003（3）：70-72.

［9］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.獸藥質量標準[S].北京：中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2006：70-77.

［10］中國色譜網(wǎng)論壇.HPLC測定替米考星的含量[EB/OL]. [2009-04-03].http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardid=1 748id=174379.

［11］岳永波，李玉霞，魏占勇，等.替米考星溶液的紫外分光光度法測定[J].河北工業(yè)科技，2012（4）：206-207.

［12］白東英，李引乾，黃勇旗，等.替米考星長效注射液的質量控制[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2008（3）：64-67.

［13］陳懿.紫外分光光度法測定替米考星注射液含量[J].獸藥與飼料添加劑，2008，13（1）：29.

［14］黃曉龍.含量測定分析方法驗證的可接受標準簡介[EB/OL]. [2016-07-18].http://www.docin.com/p-1510323168.htmL.

［15］閆春芝，趙紅彥，秦朝英.高效液相色譜法測定替米考星含量[J].中國獸藥雜志，2006（8）：26-27.

［16］冷曉紅，李曉萍，張彤.HPLC法測定磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星的含量[J].中國獸藥雜志，2014（7）：34-36.

［17］閆小峰，孫志文.高效液相色譜法測定飼料中替米考星含量[J].中國飼料，2010（9）：27.

［18］代園鳳，陳雪，黃化剛，等.甲基硫菌靈懸浮劑的高效液相色譜分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2015，43（12）：1652-1654.

［19］劉德金，劉愛玲，劉桂蘭，等.檢測替米考星含量的高效液相色譜法改良[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2011，34（3）：135-139.

［20］章一.高效液相色譜法的優(yōu)點與實際問題中的應用[J].化工管理，2014（24）：127.

Study on the Methods for Determination of the Content
of Timicosin Gelatin Microcapsules

ZHANGLiqi，ZHENGMingxue，SUXiaoqing，JI Mingxia，SHI Chenjie，BAI Rui，GONGXin，XI Rou，ZHANGLi，XUZhiyong
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Toestablish a scientific and accurate methods for determination ofthe content oftimicosin gelatin microcapsules,this test compared UV and HPLC two kinds ofanalysis methods ofspecificity,linearity,accuracy and precision ofverification.The results showed that UVmeasured timicosin（reference substances）and timicosin gelatin microcapsules had the maximumabsorption peak at（291±1）nm, and the retention time of cis-trans-isomer measured by HPLC was basically the same,two methods of complementary makings were no interference.In linearitytests,the linear range oftimicosin solution was obtained within 30.0～90.0 μg/mL,and R2UV＝0.999 4＜R2HPLC＝0.999 5.In accuracytests,the average recoveryofthe twomethods was all between 98.0%-102.0%,and RSDofthe twomethods was less than 2%,but UV was not consistent with the request in the recoveryrate ofarticle in the 45 μg/mL.In precision tests,the RSD ofthe two methods was all less than 2%.Therefore,the UV and HPLC methods can meet the requirement of determination of timicosin gelatin microcapsules,and HPLCis more accurate,which can be used todetermine the timicosin gelatin microcapsules.

timicosin gelatin microcapsules;content determination;HPLC;UV

S816.73

A

1002-2481（2016）12-1848-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.27

2016-10-12

山西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)雞產(chǎn)業(yè)技術體系項目（2013-11-03）

張李琦（1991-），男，山西定襄人，在讀碩士，研究方向：動物傳染病診斷與防治。鄭明學為通信作者。