趙 鈺,余紅嵐，宋靜芳，聶澤燕，陳 俊，馬 莉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550002;2.貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 550004)

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·論 著·

肺結(jié)核患者外周血中Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞等4種T細(xì)胞亞群與其發(fā)病的關(guān)系

趙 鈺1,余紅嵐2，宋靜芳2，聶澤燕2，陳 俊2，馬 莉1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550002;2.貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 550004)

目的 通過檢測(cè)肺結(jié)核患者和健康人群外周血中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及CD8+CD28+T細(xì)胞和CD8+CD28-T細(xì)胞的數(shù)量，探討各細(xì)胞亞群的數(shù)量與肺結(jié)核發(fā)病的關(guān)系，為結(jié)核的診斷、治療及預(yù)后提供新思路。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及CD8+CD28+T細(xì)胞和CD8+CD28-T細(xì)胞，分別比較肺結(jié)核組、初治組、復(fù)治組與健康對(duì)照組之間的上述指標(biāo)是否存在差異。結(jié)果 (1)肺結(jié)核組、初治組及復(fù)治組外周血中Th17細(xì)胞的數(shù)量分別為(0.74±0.33)%、(0.76±0.34)%、(0.73±0.32)%，CD8+CD28+T細(xì)胞的數(shù)量分別為(39.5±11.4)%、(39.5±10.9)%、(38.7±12.2)%，均分別低于健康對(duì)照組(1.17±0.38)%、(62.5±12.0)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；(2)肺結(jié)核組、初治組及復(fù)治組外周血中Treg細(xì)胞的數(shù)量分別為(10.1±2.7)%、(11.4±3.8)%、(9.4±2.5)%，CD8+CD28-T的數(shù)量分別為(60.5±11.4)%、(60.5±10.9)%、(61.3±12.2)%，均分別高于健康對(duì)照組的(7.2±2.2)%、(37.5±12.0)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；(3)初治組患者與復(fù)治組患者外周血中Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 肺結(jié)核患者外周血中的效應(yīng)性T細(xì)胞亞群Th17細(xì)胞和CD8+CD28+T細(xì)胞下降，具有抑制功能的CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞和CD8+CD28-T細(xì)胞升高，以上4個(gè)T細(xì)胞亞群可能與肺結(jié)核的發(fā)病過程相關(guān)。

肺結(jié)核；Treg細(xì)胞；Th17細(xì)胞；CD8+CD28+T細(xì)胞；CD8+CD28-T細(xì)胞

隨著Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)，兩者均迅速成為目前研究的熱點(diǎn)。Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種不同于Th1和Th2細(xì)胞的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞新亞群，該細(xì)胞是由初始T細(xì)胞前體分化而來，具有獨(dú)立的分化和發(fā)育機(jī)制，并且特異性地產(chǎn)生細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17，并由此命名。研究顯示，與健康對(duì)照組相比較，結(jié)核性胸膜炎患者外周血中Th17細(xì)胞的數(shù)量顯著降低[1]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是一群具有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞。Treg細(xì)胞在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，其可通過細(xì)胞間的接觸抑制(直接抑制)或者釋放IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β等抑制性細(xì)胞因子抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和免疫活性細(xì)胞因子的合成來調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫平衡。研究顯示，與健康人群相比較，肺結(jié)核患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量顯著升高，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的免疫功能，參與肺結(jié)核的發(fā)病[2-4]。CD8+CD28+T淋巴細(xì)胞主要執(zhí)行的是細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，特異性殺傷靶細(xì)胞,發(fā)揮細(xì)胞免疫功能；而CD8+CD28-T淋巴細(xì)胞主要參與免疫調(diào)節(jié)和反饋抑制功能。因此，本課題旨在通過檢測(cè)Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及CD8+CD28+T細(xì)胞和CD8+CD28-T細(xì)胞在肺結(jié)核患者外周血中的數(shù)量，以期探討以上各細(xì)胞亞群與肺結(jié)核發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2011年12月至2012年3月貴陽市肺科醫(yī)院住院部的肺結(jié)核患者40例設(shè)為肺結(jié)核組，男25例，女15例；年齡15～65歲，平均(37±13)歲。其中初治組(未開始用藥)24例，男15例，女9例，平均年齡(38±12)歲；復(fù)治組(不規(guī)則化療超過1個(gè)月)16 例,男11例，女5例，平均年齡(35±12)歲。具有肺結(jié)核的相關(guān)癥狀和體征，胸部X線片檢查支持肺結(jié)核的臨床診斷，同時(shí)通過痰涂片和痰培養(yǎng)結(jié)果確診為肺結(jié)核患者。具體診斷參照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008)》。無合并自身免疫性疾病、腫瘤、糖尿病及慢性感染性疾?。晃词褂糜绊憴C(jī)體免疫功能的藥物。隨機(jī)選取貴陽市第一人民醫(yī)院體檢的健康志愿者30例設(shè)為健康對(duì)照組，其中男15例，女14例，年齡15～56歲，平均(33±8)歲。胸片檢查未見異常，否認(rèn)有結(jié)核病史，血壓、肝功能、腎功能正常，無過敏性疾病，并且也未曾服用過任何影響機(jī)體免疫功能的藥物。所有受試者均簽寫了知情同意書。

1.2 方法 使用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀CantoⅡ檢測(cè)T細(xì)胞亞群，T細(xì)胞亞群檢測(cè)盒也購(gòu)于美國(guó)BD公司(除用于體外刺激轉(zhuǎn)化的佛波酯離子霉素，莫能霉素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，各項(xiàng)操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象外周血中T細(xì)胞亞群的結(jié)果比較 肺結(jié)核組患者的外周血中T細(xì)胞亞群與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。表1 肺結(jié)核患者和健康對(duì)照者外周血中T細(xì)胞

亞群的結(jié)果比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 初治組、復(fù)治組和健康對(duì)照組外周血中T細(xì)胞亞群的結(jié)果比較 初治組、復(fù)治組患者的T細(xì)胞亞群結(jié)果與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 初治/復(fù)治患者和健康對(duì)照者外周血中T細(xì)胞

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05。

3 討 論

目前，長(zhǎng)期化療引發(fā)了耐藥及多耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)和肺結(jié)核的復(fù)發(fā)，單純化療已經(jīng)不能滿足肺結(jié)核臨床治療的需要，因此迫切需要從免疫學(xué)角度尋求治療手段以達(dá)到免疫治療的目的[5]，即增加免疫對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用；降低免疫反應(yīng)對(duì)自身造成的病理?yè)p傷。

許多報(bào)道顯示，抗結(jié)核分枝桿菌感染主要由CD4+Th1細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞免疫作用， 而CD8+T細(xì)胞的免疫作用報(bào)道甚少。此次研究中，肺結(jié)核患者外周血中CD8+CD28+T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例顯著低于健康對(duì)照組。推測(cè)可能由于機(jī)體缺乏激活T淋巴細(xì)胞的第二信號(hào)，T細(xì)胞無法正?；罨?，導(dǎo)致機(jī)體不能對(duì)結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。

于韜等[6]研究認(rèn)為，CD8+CD28-T細(xì)胞是一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其功能的關(guān)鍵在于下調(diào)機(jī)體的免疫反應(yīng)，防止組織破壞，然而對(duì)免疫應(yīng)答的過度抑制會(huì)導(dǎo)致機(jī)體無法有效的對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌的感染。本次研究中，CD8+CD28-T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的比例顯著高于健康對(duì)照組，增強(qiáng)了對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制作用，機(jī)體不能有效地殺滅結(jié)核分枝桿菌，使得其在體內(nèi)不斷增殖，促進(jìn)肺結(jié)核的發(fā)展。

本次研究顯示，肺結(jié)核患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞的百分率顯著升高，與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。有研究認(rèn)為，CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞的免疫抑制性機(jī)制是通過細(xì)胞膜表面表達(dá)的CTLA-4分子實(shí)現(xiàn)的抗原特異性的細(xì)胞接觸機(jī)制，至于該抑制是通過抗原提呈細(xì)胞的介導(dǎo)作用還是直接與靶細(xì)胞相接觸發(fā)揮作用[8]，存在一定的分歧。有文獻(xiàn)報(bào)道，Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的機(jī)制與刺激抗原的濃度有關(guān)，濃度低時(shí)只需接觸抑制；濃度高時(shí)則需要分泌抑制性細(xì)胞因子輔助[9]。本次研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者外周血中的CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康對(duì)照組，而Th17細(xì)胞和CD8+CD28+T細(xì)胞數(shù)量顯著性下降。因?yàn)镃D4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞本身具有抑制其他CD4+T和CD8+T細(xì)胞亞群活化增殖的活性，推測(cè)CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞可能對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞(Th17細(xì)胞和CD8+CD28+T細(xì)胞)有抑制作用，然而關(guān)于其確切的抑制機(jī)制，仍需進(jìn)一步的探索。

有研究顯示，CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞在外周血中的平衡狀況，參與自身免疫性疾病及慢性乙型肝炎的發(fā)病過程[8-10]。本研究經(jīng)線性相關(guān)性分析結(jié)果顯示：肺結(jié)核患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。分析可能在結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體時(shí)，由于體內(nèi)存在多種細(xì)胞因子對(duì)二者的分化發(fā)育發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，最終導(dǎo)致二者在患者外周血中的數(shù)量出現(xiàn)失衡，從而參與肺結(jié)核的免疫發(fā)病過程。

由于本次研究選取的初治組患者未開始用藥，而復(fù)治組是不規(guī)則用藥超過1個(gè)月的患者，與健康對(duì)照組相比較，患者外周血中發(fā)揮抑制性作用的CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞、CD8+CD28-T細(xì)胞數(shù)量顯著升高，發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用的Th17細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞數(shù)量顯著降低；但兩組患者之間比較，各個(gè)細(xì)胞亞群的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示由于用藥不規(guī)則，未能有效調(diào)動(dòng)機(jī)體主動(dòng)抗結(jié)核免疫機(jī)制，外周血中抑制性T細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，這可能是導(dǎo)致疾病遷延不愈的一方面原因。

近年來，結(jié)核病卷土重來，發(fā)病率和復(fù)發(fā)率逐漸上升，鑒于化療較長(zhǎng)的療程及耐藥性的出現(xiàn)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力對(duì)于結(jié)核病的防治工作具有重要意義。單純研究CD8+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28-T細(xì)胞和CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞的文章見諸報(bào)道，但本次實(shí)驗(yàn)從肺結(jié)核患者與健康人群之間以上4個(gè)T細(xì)胞亞群相比較的角度，發(fā)現(xiàn)原有的Th1/Th2細(xì)胞平衡機(jī)制或者某個(gè)細(xì)胞亞群的作用研究已經(jīng)不足以解釋肺結(jié)核的免疫發(fā)病機(jī)理，結(jié)果提示Th17細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞、CD8+CD28-T細(xì)胞和CD4+CD25+CD127low/-Treg細(xì)胞共同參與了肺結(jié)核的發(fā)病過程，由此考慮是否可以將其作為患者免疫功能調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，與化療藥物相結(jié)合，從而縮短化療的療程，使疾病盡快得到治愈。盡管參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子比較復(fù)雜，并且其彼此之間具有網(wǎng)絡(luò)性的相互作用，但本次實(shí)驗(yàn)研究的4個(gè)細(xì)胞亞群的狀況至少可以為肺結(jié)核的臨床診斷、預(yù)后及免疫治療提供一種新的思路。

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Relation between 4 kinds of peripheral blood T cell subsets of Treg cell and Th17 cell in patients with pulmonary tuberculosis and its onset

ZHAOYu1,YUHonglan2,SONGJingfang2,NIEZeyan2,CHENJun2,MALi1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,GuiyangMunicipalFirstPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.CentralLaboratory,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

Objective To investigate the relationship between the number of various cellular subsets and pulmonary tuberculosis(TB) onset by detecting the number of peripheral blood Treg cells,Th 17 cells,CD8+CD28+T cells and CD8+CD28-T cells in the patients with pulmonary TB and healthy population so as to provide a new thinking for the diagnosis,treatment and prognosis of TB.Methods Treg cells,Th 17 cells,CD8+CD28+T cells and CD8+CD28-T cells were detected by using flow cytometry (FCM).The differences of these indexes were compared among the pulmonary TB group,initial treatment group,re-treatment group and healthy control group.Results (1) The percentages of peripheral blood Th17 cells and CD8+CD28+T cells in the TB group,initial treatment group and re-treatment group respectively were(0.74±0.33)%,(0.76±0.34)%,(0.73±0.32)% and (39.5±11.4)%,(39.5±10.9)%,(38.7±12.2)% respectivel;which were lower than(1.17±0.38)% and(62.5±12.0)% in the control group,the difference was statistical significance(P<0.01);(2) the percentages of peripheral blood Treg cells and CD8+CD28-T cells in the TB group,initial treatment group and re-treatment group were (10.1±2.7)%,(11.4±3.8)%,(9.4±2.5)% and (60.5±11.4)%,(60.5±10.9)%,(61.3±12.2)% respectively;which were higher than (7.2±2.2)% and(37.5±12.0)% in the healthy control group,the difference was statistical significance(P<0.01);(3) the percentages of peripheral blood Th17 cells,Treg cells,CD8+CD28+T cells and CD8+CD28-T cells had no statistical difference between the initial treatment group and re-treatment group (P>0.05).Conclusion The percentage of peripheral blood effect T cell subsets Th17 cells and CD8+CD28-T cells in the patients with pulmonary TB is decreased,while the percentage of CD4+CD25+CD127low/-Treg cells and CD8+CD28-T cells with the inhibiting effect is increased,these 4 kinds of T cell subsets may be related to the onset process of pulmonary TB.

pulmonary tuberculosis; Treg cell; Th17 cell; CD8+CD28+T cell; CD8+CD28-T cell

趙鈺，女，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.019

A

1673-4130(2016)24-3434-03

2016-09-01

2016-10-20)