時廣利，班武娟，陳 燕，尹顏軍，白萬秋，丁湘彧

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149)

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·論 著·

血清miR-6801在非小細(xì)胞肺癌輔助診斷中的臨床意義

時廣利，班武娟，陳 燕，尹顏軍，白萬秋，丁湘彧△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京 101149)

目的 探討血清miR-6801在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中的表達(dá)水平及其在NSCLC輔助診斷中的臨床意義。方法 采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測40例健康人和78例NSCLC患者血清中miR-6801的表達(dá)量,并構(gòu)建受試者操作特征(ROC)曲線計算血清miR-6801的靈敏度和特異度。結(jié)果 NSCLC患者血清中miR-6801的表達(dá)水平顯著低于健康者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表達(dá)水平顯著低于Ⅰ期+Ⅱ期(P<0.05)；血清miR-6801對NSCLC檢測的靈敏度為51.9%；miR-6801對Ⅰ期、Ⅱ期NSCLC檢測的靈敏度為40.6%。結(jié)論 NSCLC患者miR-6801的檢測對于NSCLC的輔助診斷和早期診斷有一定的臨床應(yīng)用價值。

非小細(xì)胞肺癌； 微小RNA； 輔助診斷； 聚合酶鏈反應(yīng)

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤之一，其病死率居各種惡性腫瘤之首。75%～80%的肺癌患者為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其5年存活率僅為15%～20%，而Ⅰa期發(fā)現(xiàn)并治療的患者，5年生存率可達(dá)80%[1]。缺乏有效的NSCLC早期診斷手段是NSCLC患者高病死率的主要原因[2]。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性高度保守的長度為18～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有致癌和抑癌的不同作用[3]。miRNA在血清中非常穩(wěn)定，有可能作為診斷肺癌的新血清標(biāo)志物[4]。因此，本研究對NSCLC患者與健康者血清中miR-6801的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，探討血清miR-6801表達(dá)水平在NSCLC輔助診斷中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年8月至2015年10月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院收治的初治NSCLC患者78例(NSCLC組)，其中男45例、女33例，年齡41～73歲(平均50.1歲)，其中肺腺癌38例、肺鱗癌40例。所有NSCLC患者全部經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)確診，既往未進(jìn)行放療或化療，肺癌分期參照2002年美國癌癥聯(lián)合協(xié)會(AJCC)標(biāo)準(zhǔn)。健康對照組為北京胸科醫(yī)院體檢健康職工40例，其中男19例、女21例，年齡25～55歲(平均39.4歲)，無高血壓、高血脂、糖尿病等基礎(chǔ)性疾病。

1.2 標(biāo)本采集 用真空采血管收集NSCLC患者和健康人空腹外周靜脈血4 mL。所有標(biāo)本經(jīng)4 000 r/min離心后分離出血清，收集后的血清標(biāo)本放至-80 ℃超低溫冰箱中冷凍，集中進(jìn)行miRNA的提取。此研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過。

1.3 方法

1.3.1 血清標(biāo)本miRNA的提取 按照北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的miRNA提取試劑盒的操作說明書提取所有血清標(biāo)本中的miRNA，使用Quawell Q3000微量核酸檢測儀對提取的miRNA進(jìn)行檢測。

1.3.2 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) qRT-PCR實(shí)驗(yàn)以合成的cDNA為模板，同時以miR-103作為內(nèi)參照。qRT-PCR反應(yīng)為20 μL體系，PCR反應(yīng)循環(huán)條件：94 ℃預(yù)熱2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共進(jìn)行45個循環(huán)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過Lightcycler 480Ⅱ軟件進(jìn)行分析，每個cDNA標(biāo)本的表達(dá)量檢測均重復(fù)3次，血清miRNA的相對表達(dá)量用2-ΔCt表示。

1.3.3 血清標(biāo)本癌胚抗原(CEA)的檢測 所有血清標(biāo)本CEA的濃度測定釆用流式熒光免疫法，CEA檢測試劑盒由上海透景生物科技有限公司生產(chǎn)，應(yīng)用美國LUMINEX200流式熒光點(diǎn)陣分析儀進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以中位數(shù)(四分位間距)表示。多組間血清miRNA相對表達(dá)量比較采用Kruskal WallisH檢驗(yàn)，兩組之間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；通過受試者操作特征曲線(ROC)分析miRNA表達(dá)水平對NSCLC診斷價值，并計算95%置信區(qū)間；組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清miR-6801相對表達(dá)量的檢測結(jié)果 NSCLC組患者血清中miR-6801的表達(dá)水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.128,P<0.05)；NSCLC組患者血清中miR-6801的表達(dá)水平與患者性別及吸煙狀態(tài)不相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NSCLC組經(jīng)TNM分期后，血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表達(dá)水平顯著低于Ⅰ期+Ⅱ期(Z=2.081,P<0.05)；NSCLC組經(jīng)病理分期后，血清miR-6801在腺癌中的表達(dá)水平與鱗癌比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組研究對象血清中miR-6801的相對表達(dá)量

注：與健康對照組比較，*P=0.029；與Ⅰ期+Ⅱ期比較，#P=0.041。

2.2 血清miR-6801對NSCLC檢測的靈敏度 血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC中檢測的靈敏度(57.8%)顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期(40.6%)(χ2=5.565,P<0.05)；血清miR-6801對早期NSCLC(Ⅰ期+Ⅱ期)檢測的靈敏度(40.6%)顯著高于CEA(21.9%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.875,P<0.05)；血清miR-6801在肺腺癌中檢測的靈敏度與肺鱗癌比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 血清miR-6801對NSCLC檢測的靈敏度(%)

注：與CEA比較，*P=0.024；與Ⅰ期+Ⅱ期比較，#P=0.038。

2.3 血清miR-6801在NSCLC中的診斷價值分析 應(yīng)用ROC曲線分析血清miR-6801在NSCLC中的診斷價值，血清miR-6801診斷NSCLC的ROC曲線下面積(AUC)為0.732,95%置信區(qū)間(CI)=0.628～0.831；血清miR-6801對NSCLC的診斷價值高于血清CEA(AUC=0.596，95%CI=0.484～0.709)。

3 討 論

目前，CT、X線片等影像學(xué)檢查及支氣管鏡和痰脫落細(xì)胞檢查是最常用的肺癌檢測手段。但是，胸片和痰脫落細(xì)胞檢查在肺癌診斷中的靈敏度比較低。支氣管鏡檢查為侵入性方式檢查。而CT檢查由對肺癌診斷的靈敏度過高而容易引起假陽性。盡管有人建議低劑量螺旋CT可作為肺癌篩查的常規(guī)手段，但仍處于研究階段[5]。腫瘤標(biāo)志物對肺癌的輔助診斷、早期診斷、預(yù)后判斷和療效監(jiān)測具有重要的應(yīng)用價值。但是，目前應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物在肺癌診斷中的靈敏度較低，尤其是在早期肺癌(Ⅰ期+Ⅱ期)中的靈敏度更低，對于肺癌的診斷具有很大的局限性[6]。因此，尋找新型、并且特異度和靈敏度都比較好的血液腫瘤標(biāo)志物是當(dāng)今臨床迫切需要的。

miRNA在細(xì)胞的增殖、凋亡、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用，miRNA有可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)記物[7]。目前，血清中miRNA作為惡性腫瘤分子標(biāo)志的研究是近幾年來的研究熱點(diǎn)。血清miRNA的來源，認(rèn)為主要來自于壞死或凋亡的細(xì)胞，或者來自于腫瘤細(xì)胞釋放的內(nèi)源性miRNA入血[4]。miRNA在血清中能夠非常穩(wěn)定地存在，能夠抵抗RNA內(nèi)切酶的降解[8]。Shen等[9]研究顯示，聯(lián)合檢測血漿miR-21、miR-126、miR-210和miR-486-5p這4種miRNA對NSCLC檢測的靈敏度和特異度高達(dá)86.2%和96.5%；對Ⅰ期NSCLC檢測的靈敏度和特異度為73.3%和96.5%。Zheng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，血漿miR-155、miR-197及miR-182在Ⅰ期肺癌患者中的表達(dá)水平顯著上升，這3種miRNA對肺癌檢測的靈敏度和特異度為81.3%和86.7%。Roth等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b、miR-34a、miR-141在肺癌患者血清的表達(dá)水平明顯高于良性疾病組和對照組，并與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。Zhu等[12]研究結(jié)果顯示，肺癌患者血清中miR-183家族(包括miR-96、miR-182和miR-183)的表達(dá)水平顯著高于健康對照組，并且與肺癌患者的生存期密切相關(guān)。目前的這些研究提示，血清中miRNA表達(dá)水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展和病理過程密切相關(guān)，并且miRNA有可能參與肺癌的早期形成階段。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清中miR-6801的表達(dá)水平顯著低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期中的表達(dá)水平顯著低于Ⅰ期+Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清miR-6801在Ⅲ期+Ⅳ期NSCLC中檢測的靈敏度(57.8%)顯著高于Ⅰ期+Ⅱ期(40.6%)(P<0.05)；血清miR-6801對早期NSCLC(Ⅰ期+Ⅱ期)檢測的靈敏度(40.6%)顯著高于CEA(21.9%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以上研究結(jié)果表明，血清miR-6801作為篩查NSCLC的腫瘤標(biāo)志物具有潛在的臨床應(yīng)用價值，并且有可能成為NSCLC早期診斷的參考指標(biāo)。

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Clinical significance of serum miR-6801 in auxiliary diagnosis of non-small cell lung cancer

SHIGuangli,BANWujuan,CHENYan,YINYanjun,BAIWanqiu,DINGXiangyu△

(DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedBeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China)

Objective To investigate the expression level of serum miR-6801 in non-small cell lung cancer (NSCLC) and its clinical significance in the auxiliary diagnosis of NSCLC.Methods The real-time quantitative PCR method was adopted to examine the expression amount of serum miR-6801 in 78 NSCLC patients and 40 healthy controls.The sensitivity and specificity of miR-6801 in the diagnosis of NSCLC were evaluated by receiver operating characteristic (ROC) curve.Results The expression level of miR-6801 in the patients with NSCLC was significantly lower than that in healthy controls with statistical difference (P<0.05);the expression level of miR-6801 at stages Ⅲ and Ⅳ was significantly lower than that at stages Ⅰ and Ⅱ (P<0.05);the sensitivity of miR-6801 in detecting NSCLC was 51.9%，and the sensitivities of miR-6801 in the stage I and II of NSCLC was 40.6 %．Conclusion The serum miR-6801 detection has a certain clinical application value for auxiliary diagnosing and early diagnosing of NSCLC.

non-small cell lung cancer； miRNA； auxiliary diagnosis； polymerase chain reaction

時廣利，男，主任技師，主要從事分子生物學(xué)研究。△

，E-mail:dingxymail@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.012

A

1673-4130(2016)24-3416-03

2016-09-01

2016-10-20)