楊 帆，陳英劍，胡成進(jìn)△

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧錦州 121001；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，濟(jì)南 250031)

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·論 著·

基于質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用CLINPROT系統(tǒng)建立乳腺癌診斷模型*

楊 帆1，陳英劍2，胡成進(jìn)2△

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生院，遼寧錦州 121001；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，濟(jì)南 250031)

目的 應(yīng)用液體蛋白芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(CLINPROT)系統(tǒng)篩選乳腺腫瘤患者血清中潛在的腫瘤標(biāo)志物，并基于差異蛋白建立乳腺癌診斷預(yù)測模型。方法 收集病理確診的乳腺癌患者血清標(biāo)本43例及健康女性血清標(biāo)本24例，并隨機(jī)分為建模組和驗(yàn)證組。應(yīng)用ClinProt Tools系統(tǒng)對建模組中的乳腺癌患者和健康女性血清進(jìn)行差異蛋白的篩選，建立差異蛋白質(zhì)圖譜，應(yīng)用ClinProTools v3.0 軟件建立乳腺癌診斷預(yù)測模型，而后利用該診斷模型對驗(yàn)證組血清標(biāo)本進(jìn)行分組驗(yàn)證，初步評估該模型的診斷效能。結(jié)果 通過分析病例組和對照組質(zhì)譜峰信息，得到24個(gè)具有明顯差異的蛋白峰(P<0.05)。根據(jù)遺傳算法選取表達(dá)差異最顯著的3個(gè)蛋白質(zhì)建立乳腺癌診斷預(yù)測模型，該模型對建模組乳腺癌的識(shí)別能力為91.67%。后利用驗(yàn)證組標(biāo)本對該模型的診斷效能進(jìn)行評估，結(jié)果顯示其對驗(yàn)證組乳腺癌識(shí)別準(zhǔn)確率為85.7%。 結(jié)論 利用ClinProt Tools v3.0軟件成功建立并評估了乳腺癌診斷預(yù)測模型，為乳腺癌診斷提供了新的途徑。

液體蛋白芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)； 乳腺癌； 診斷模型

液體蛋白芯片-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(CLINPROT)系統(tǒng)是由德國布魯克道爾頓公司基于質(zhì)譜開發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和鑒定系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要由4個(gè)子系統(tǒng)組成：磁珠富集低豐度蛋白質(zhì)/多肽、質(zhì)譜采集、CLINPROT軟件和體液樣品自動(dòng)處理系統(tǒng)?；具^程：將患者或健康對照的臨床樣品通過磁珠進(jìn)行分離，去除樣品中的高豐度蛋白和雜質(zhì)，將分離后的蛋白質(zhì)/多肽樣本與基質(zhì)混合后，直接點(diǎn)在拋光靶上，通過MALDI TOF/TOF MS進(jìn)行分析，得到兩組蛋白的總質(zhì)譜圖，通過CLINPROT系統(tǒng)比較病例組與對照組表達(dá)差異的蛋白，生成平均質(zhì)譜圖、膠狀圖等，用于臨床未知樣品的預(yù)測[1]。目前，多項(xiàng)研究均利用了CLINPROT系統(tǒng)對腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了前瞻性研究，包括宮頸鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等[2-5]。CLINPROT系統(tǒng)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的新技術(shù)，為發(fā)現(xiàn)新型腫瘤標(biāo)志物提供了新的途徑。本研究應(yīng)用該技術(shù)對乳腺癌患者血清蛋白進(jìn)行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2015 年 1 月至2016 年 1 月收治的乳腺癌女性患者血清標(biāo)本43例作為病例組，平均年齡(45.0±3.4) 歲。所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)確診，術(shù)前均未進(jìn)行臨床治療。另選濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院同期健康體檢的女性血清24例作為對照組，納入對照女性既往無乳腺癌及相關(guān)疾病，體檢未見其他惡性疾病，平均年齡(43.0±5.2)歲。病例組與對照組年齡等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 試劑與儀器 弱陽離子交換磁珠分析試劑盒(MB-WCX)、疏水磁珠分析試劑盒(MB-HIC C8)、金屬螯合磁珠分析試劑盒(MB-IMAC-Cu)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白/多肽購自德國 Bruker公司。三氟乙酸(TFA)、乙腈、丙酮購自Sigma-Aldrich公司。血清蛋白質(zhì)譜圖的采集采用德國Bruker公司基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，并使用儀器原裝進(jìn)口配套的試劑和定標(biāo)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集和預(yù)處理 受檢對象均進(jìn)行清晨空腹采血，采集靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 3種磁珠分析試劑盒富集血清低豐度蛋白 分別采用不同分離原理的磁珠試劑盒MB-WCX、MB-HIC C8、MB-IMAC-Cu提純4例乳腺癌患者和4例健康對照女性血清中的低豐度蛋白，根據(jù)平均出峰量、信噪比、峰強(qiáng)度等系數(shù)比較3種分離試劑盒的提純效果。

1.3.3 CLINPROT系統(tǒng)重復(fù)性檢測 將已富集的4例乳腺癌患者和4例健康對照女性血清中的低豐度蛋白經(jīng)MALDI-TOF/TOF MS連續(xù)檢測5次，分別獲得不同批間質(zhì)譜圖。再應(yīng)用ClinProt Tools v3.0軟件分析采集質(zhì)譜圖，計(jì)算每批質(zhì)譜圖的變異系數(shù)(CV)，通過比較批間變異系數(shù)變化評價(jià)本方法的重復(fù)性。

1.3.4 MB-WCX富集血清低豐度蛋白 根據(jù)磁珠分選結(jié)果，采用弱陽離子交換磁珠分析試劑盒處理43例乳腺癌和24例健康女性血清標(biāo)本。(1) 磁珠吸附標(biāo)本。將10 μL MB-WCX磁珠、10 μL結(jié)合緩沖液(BB)和5 μL 待測血清加入樣品管，顛倒混勻；室溫靜置 5 min；利用磁性分離器分離磁珠1 min，使磁珠與上清液徹底分離；用加樣槍吸出上清液，應(yīng)避免槍頭接觸和吸走磁珠；(2)洗滌磁珠。加入100 μL 洗滌緩沖液(WB)；在磁性分離器相鄰位置反復(fù)移動(dòng)，徹底分離上清液；(3)洗脫磁珠。將分離后的上清液中加入5 μL洗脫緩沖液(EB)混勻，將樣品管置于磁珠分離器中靜置2 min，分離上清液，最后加入5 μL穩(wěn)定緩沖液(SB)，充分混勻后，24 h內(nèi)利用MALDI TOF/TOF MS進(jìn)行分析。

1.3.5 樣品上樣分析 稀釋1 μL多肽樣品溶液于10 μL混合基質(zhì)溶液中，充分混勻；加1 μL混合液于MTP 384 target plate polished steel BC靶板的相應(yīng)位置上，室溫風(fēng)干后進(jìn)行質(zhì)譜分析,采集每例血清標(biāo)本低豐度蛋白表達(dá)質(zhì)譜圖。

1.3.6 生物信息學(xué)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 (1)FlexAnalysis軟件數(shù)據(jù)分析。在FlexAnalysis軟件中打開待分析數(shù)據(jù)，編輯找峰參數(shù)，通過平滑、基線處理、校正等方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后，進(jìn)行標(biāo)峰，并檢查已采集圖譜質(zhì)量。(2)ClinProt Tools v3.0軟件建立乳腺癌診斷模型。打開ClinProt Tools v3.0軟件，設(shè)置一般參數(shù)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑、對齊、歸一化處理，然后將模型組(36例乳腺癌患者和17例健康女性標(biāo)本)質(zhì)譜圖調(diào)入軟件，對所有峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)生成峰統(tǒng)計(jì)列表和準(zhǔn)膠圖，在對每張譜圖中的峰高和峰面積進(jìn)行標(biāo)注。最后利用對峰參數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，根據(jù)遺傳算法建立乳腺癌診斷預(yù)測模型。(3)乳腺癌診斷模型的驗(yàn)證。利用ClinProt v3.0軟件用建立的乳腺癌診斷模型對驗(yàn)證組標(biāo)本(7例乳腺癌和7例健康對照)進(jìn)行雙盲驗(yàn)證，檢測診斷模型的診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1 磁珠分選結(jié)果 本研究首先對3種磁珠分離蛋白質(zhì)/多肽方法MB-WCX、MB-HIC C8、MB-IMAC-Cu進(jìn)行了比較，以選擇最佳的富集方法進(jìn)行后續(xù)的大樣本試驗(yàn)。利用3種磁珠富集4例乳腺癌患者和4例健康對照女性血清中的低豐度蛋白，然后通過MALDI TOF/TOF MS的FlexControl軟件進(jìn)行質(zhì)譜圖的采集，分別生成3種方法的峰統(tǒng)計(jì)列表，經(jīng)比較后發(fā)現(xiàn) MB-WCX在平均出峰量、平均峰面積、平均峰強(qiáng)度等方面均優(yōu)于MB-HIC C8和MB-IMAC-Cu。因此選擇MB-WCX作為后續(xù)大樣本血清富集方法。

2.2 CLINPROT系統(tǒng)重復(fù)性檢測 反復(fù)測定8例標(biāo)本(4例乳腺癌血清、4例健康女性血清)富集的低豐度蛋白，經(jīng)MALDI-TOF/TOF MS和ClinProt Tools v3.0軟件分析，得到5次測定質(zhì)譜圖信息和平均CV，結(jié)果顯示5次測定質(zhì)譜圖基本一致，病例組平均CV為24.5%，對照組平均CV為19.7%，當(dāng)CV<30%，即表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 血清差異蛋白的定量分析 將乳腺癌患者和健康對照血清經(jīng)MB-WCX分析試劑盒富集得到的蛋白質(zhì)/多肽通過MALDI TOF/TOF MS分別采集兩組質(zhì)譜圖，應(yīng)用FlexAnalysis軟件將質(zhì)譜圖進(jìn)行均一化處理后，導(dǎo)入ClinProt Tools v3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生成平均質(zhì)譜圖、峰統(tǒng)計(jì)列表、膠狀圖等，發(fā)現(xiàn)了24個(gè)具有明顯差異的蛋白峰(P<0.05)，其中差異最明顯的分別是Mass 3 348.9、Mass 4 787.5、Mass 5 750.1和Mass 8 141.6(表1)。

表1 乳腺癌和健康對照相比具有明顯差異的蛋白質(zhì)

2.4 乳腺癌診斷預(yù)測模型的建立 將模型組質(zhì)譜圖導(dǎo)入ClinProt Tools v3.0軟件，根據(jù)遺傳算法選取表達(dá)差異最顯著的3個(gè)蛋白質(zhì)建立乳腺癌診斷預(yù)測模型，對乳腺癌和健康對照的識(shí)別能力分別為91.6%和100.0%，建立模型的3個(gè)蛋白質(zhì)曲線下面積分別為0.84、0.86和0.85。后為了驗(yàn)證該模型的診斷效能，利用驗(yàn)證組標(biāo)本對該診斷模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示其對乳腺癌和健康對照的識(shí)別準(zhǔn)確率均為85.7%(6/7)。診斷乳腺癌的靈敏度為85.7%，特異度為85.7%，Youden指數(shù)為0.714。根據(jù)ClinProt Tools選取的兩個(gè)差異較為明顯的蛋白質(zhì)Mass 3 348.9和Mass 5 750.1進(jìn)行聚類分析，可見兩組交叉面積較小，且趨勢明顯，說明該模型鑒別能力較好。

3 討 論

腫瘤性疾病的早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療是降低病死率和改善患者生活質(zhì)量的重要途徑。乳腺癌早期臨床癥狀不明顯，患者一般至預(yù)后較差的中后期就診，大大降低了生存率[6-7]。目前乳腺癌診斷還是依靠影像學(xué)檢查和病理診斷為依據(jù)[8-10]，而有研究表明在腫瘤性疾病發(fā)病早期，血液中腫瘤標(biāo)志物的升高要先于影像學(xué)檢查[11]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，會(huì)同時(shí)伴隨著多種生物標(biāo)志物不同程度的升高或降低。目前，癌胚抗原(CEA)和癌抗原CA15-3等已作為乳腺癌血清標(biāo)志物開始應(yīng)用于臨床乳腺癌患者的輔助診斷和預(yù)后判斷，但多項(xiàng)研究表明兩者靈敏度以及對乳腺癌的早篩準(zhǔn)確率都不夠理想[12-13]。因此，需要更多有關(guān)于乳腺血清腫瘤標(biāo)志物的研究來滿足臨床乳腺癌診斷的需求。

液體芯片-MALDI TOF/TOF MS-CLINPROT系統(tǒng)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行高通量分析的一種新技術(shù)，其主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，節(jié)省標(biāo)本，且能夠直接對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。該技術(shù)已經(jīng)在前列腺癌、卵巢癌和膀胱癌等早期診斷方面進(jìn)行了一系列的前瞻性研究[14-16]，建立了多種預(yù)測診斷模型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)有潛力的腫瘤標(biāo)志物，并通過Mascot搜庫成功鑒定，為腫瘤性疾病致病機(jī)制的進(jìn)一步探索奠定了基礎(chǔ)。

本研究應(yīng)用液體芯片-MALDI-TOF/TOF MS-CLINPROT系統(tǒng)分析了36例乳腺癌患者和17例健康體檢女性血清蛋白質(zhì)譜，通過比較發(fā)現(xiàn)了24個(gè)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的蛋白質(zhì)/多肽。其中Mass 5 750.1和8 141.6在乳腺癌血清中均呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，診斷乳腺癌的ROC曲線下面積分別為0.86和0.85，證明兩個(gè)差異蛋白有潛力成為有價(jià)值的乳腺腫瘤新型標(biāo)志物。ClinProt Tools v3.0軟件根據(jù)遺傳算法選擇3個(gè)差異最顯著的蛋白Mass 3 348.9、Mass 5 750.1和Mass 8 141.6建立了乳腺癌預(yù)測診斷模型，該模型能有效地區(qū)分乳腺癌和健康人。后通過7例乳腺癌患者和7例健康對照血清對該模型進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示其對乳腺癌診斷的準(zhǔn)確率達(dá)到85.7%，靈敏度為85.7%，特異度為85.7%，Youden 指數(shù)為0.714。該模型的診斷效能明顯高于目前臨床血清標(biāo)志物的聯(lián)合診斷，具有重要的臨床應(yīng)用前景。

本研究建立了診斷效能較高的乳腺癌預(yù)測診斷模型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)有價(jià)值的血清腫瘤標(biāo)志物，為后續(xù)的鑒定和體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)的探究奠定了基礎(chǔ)。由于本研究時(shí)間有限，病例數(shù)少，建立的診斷模型有其局限性，今后有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

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Establishment of diagnostic model of breast cancer by using CLINPROT system based on MALDI-TOF/TOF MS*

YANGFan1,CHENYingjian2,HUChengjin2△

(1.PostgraduatesSchool,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China;2.DepartmentofLaboratoryDiagnosis,GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan,Shandong250031,China)

Objective To use the liquid protein chip-MALDI-TOF/TOF MS CLINPROT system for screening the serum potential tumor markers in the patients with breast tumor and to establish the breast cancer diagnostic prediction model basic on differential protein.Methods Forty-three serum samples from the patients with pathologically diagnosed breast cancer and 24 serum samples from healthy female controls were collected and randomly divided into the construction model group and verification group.The differential protein screening in the breast cancer patients of the constructing model group and healthy female serum was performed by using the CLINPROT system.The differential protein atlas was established.The breast cancer diagnotic prediction model was established by using the Clin Prot Tools v3.0 software.Then the diagnostic model was applied to perform the grouping verification in the serum samples of verification group.The diagnostic efficiency of this model was preliminarily evaluated.Results Twenty-four protein peaks with significant difference were obtained by analyzing the mass spectrum peak information of the patients group and control group(P<0.05).Three proteins expressing the difference most significantly were selected to build a breast cancer diagnostic prediction model according to genetic algorithm,and the recognition ability of this model for breast cancer in the construction model group was 91.67%.Then the diagnostic efficiency of this model was evaluated by using the samples of verification group,and the results showed that its recognition accuracy rate to breast cancer in the verification group was 85.7%.Conclusion Using the ClinProt Tools v3.0 software successfully constructs and evaluates the diagnostic prediction model of breast cancer,which provides a new pathway for the diagnosis of breast cancer.

CLINPROT system; breast cancer; diagnostic model

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472497)。

楊帆，女，技師，主要從事臨床檢驗(yàn)研究?！?/p>

，E-mail:hcj6289@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.002

A

1673-4130(2016)24-3388-03

2016-09-07

2016-10-26)