劉寶元 ， 孫亞妮 ， 陳宜陽 ， 趙 欽 ， 周恩民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)陜西科學(xué)觀測實驗站， 陜西楊凌712100)

在肝臟腫大和產(chǎn)蛋率下降綜合征病雞中檢出禽戊型肝炎病毒核酸

劉寶元 ， 孫亞妮 ， 陳宜陽 ， 趙 欽 ， 周恩民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用藥物與獸醫(yī)生物技術(shù)陜西科學(xué)觀測實驗站， 陜西楊凌712100)

為弄清遼寧某蛋雞場雞只產(chǎn)蛋量突然下降， 死亡率上升及部分剖檢雞只肝臟腫大出血的原因， 對采集的發(fā)病雞肝臟組織進行病理學(xué)觀察， 同時對腸道內(nèi)容物進行禽戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus, HEV)核酸片段的RT-PCR檢測。 肝臟的組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)， 肝細胞壞死和匯管區(qū)周圍淋巴細胞浸潤；RT-PCR從腸道內(nèi)容物中成功擴增到禽HEV ORF2基因的部分片段；基因序列同源性分析結(jié)果表明， 其與國內(nèi)禽HEV參考株的序列同源性為97.5%～99.6%， 而與其他國家的HEV序列同源性為77.9%～97.6%；進化樹分析表明， 該序列(命名為China 15-LN)與國內(nèi)其他地區(qū)及歐洲的部分分離株在同一進化分支上， 同屬禽HEV基因3型。

禽戊型肝炎病毒 ； 分離鑒定 ； 序列分析

禽戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)是雞的大肝大脾病(Big liver and spleen disease, BLS)或肝炎脾大綜合征(Hepatitis-Splenomegaly, HS)的主要病原，該病主要引起30～72周齡的蛋雞和肉種雞產(chǎn)蛋率下降(20%～40%)和死淘率升高(1%～4%)，部分雞腹部充血、卵巢退化、偶有肝脾腫大，是危害養(yǎng)禽業(yè)尤其是蛋雞和種禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[1]。許多國家先后有過BLS或HS綜合征暴發(fā)的報道[2-9]。

2015年7月遼寧某海藍褐蛋雞場的雞只(30周齡)產(chǎn)蛋率突然下降約30%，同時伴隨死淘率上升4%左右，部分雞只剖檢癥狀表現(xiàn)肝臟腫大、出血和壞死。依據(jù)臨床表現(xiàn)和剖檢病變，初步懷疑為由禽HEV感染引發(fā)的雞BLS。隨后，通過對病死雞肝臟的病理學(xué)觀察和對腸道內(nèi)容物中禽HEV核酸的RT-PCR檢測進行實驗室診斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟的肝細胞嚴重壞死并且匯管區(qū)周圍出現(xiàn)嚴重的淋巴細胞浸潤，而腸道內(nèi)容物中也擴增到禽HEV核酸片段。試驗結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 解剖學(xué)及病理學(xué)觀察 對病死雞進行剖檢，肉眼觀察肝臟組織的病變，同時取小塊肝組織于10%福爾馬林液固定，常規(guī)方法制作石蠟切片并進行 H.E.染色。最后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.2 病毒基因的克隆擴增與序列分析

1.2.1 樣品采集與處理 收集病死雞腸道內(nèi)容物，用無菌PBS(pH值=7.2)按照質(zhì)量體積比制成10%懸浮液，3 500 r/min(4℃)離心10 min，吸取200 μL上清液用于病毒RNA提取。

1.2.2 樣品中禽HEV RNA檢測 參考Z F Sun等的方法[10]，合成擴增ORF2部分序列的巢式PCR引物，目的片段分別為278 bp和242 bp。首先按照TRIZol和Superscript II 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)的使用說明書，從200 μL腸道內(nèi)容物上清液中進行總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄。然后按照Transtaq High Fidelity DNA 聚合酶(TransGen Biotech)說明書進行巢式PCR擴增，最后取5 μL PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。

1.2.3 序列測定與分析 按照EasyPure Quick Gel Extraction試劑盒(TransGen Biotech)的說明書對PCR產(chǎn)物進行凝膠回收純化，然后與pMD18-T Vector連接，陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將獲得的序列利用DNAStar軟件進行分析，并與GenBank上禽HEV的參考序列進行同源性和進化樹分析。所用參考序列的GenBank登錄號為：GQ398041，GQ398042，AY870827，F(xiàn)M872317，F(xiàn)M872312，AY870829，EU919193和FM872314。

2 結(jié)果

2.1 病死雞肝臟的解剖學(xué)及病理學(xué)觀察 剖檢可見部分病死雞只肝臟腫大、出血(見中插彩版圖1A)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病死雞肝臟的肝細胞嚴重壞死，匯管區(qū)周圍大量淋巴細胞浸潤(見中彩插版圖1B)，呈現(xiàn)出典型禽HEV感染雞只后引發(fā)的肝臟顯微病理學(xué)變化。并未觀察到J亞群禽白血病引發(fā)的骨髓樣細胞瘤病變(瘤細胞胞漿內(nèi)有紅染顆粒)。

2.2 禽HEV核酸檢測與分析

2.2.1 禽HEV核酸擴增 收集的樣品提取總RNA后，利用禽HEV的特異性檢測引物，巢式RT-PCR方法擴增得到了預(yù)期的目的片段，其大小為 242 bp(圖2)。

圖2 PCR擴增結(jié)果

M：Trans2K ? Plus II DNA Marker； 1-3：樣本； 4：陰性對照

2.2.2 序列分析 利用DNAStar軟件包里的MegAlign程序，將獲得的序列與GenBank上參考序列進行同源性分析，結(jié)果顯示，其與國內(nèi)的禽HEV參考序列(China 09-Z56，China 09-G57)的同源性為97.5%-99.6%，與澳大利亞，美國，西班牙，德國和匈牙利等國的參考序列的同源性為77.9%-97.6%(表1)。同源性分析提示，獲得的序列為禽HEV核酸序列，命名為China 15-LN。

表1 部分禽HEV ORF2基因序列與GenBank上部分禽HEV序列同源性分析 %

利用DNAStar軟件包里的Clustal W程序構(gòu)建進化樹，結(jié)果顯示，China 15-LN與國內(nèi)禽HEV及歐洲的和美國部分分離株在同一進化分支上，同屬于禽HEV基因3型(圖3)。

3 討論

本次發(fā)病，蛋雞場的雞只在30周齡時出現(xiàn)產(chǎn)蛋量突然下降約30%，同時伴隨雞只死淘率上升4%左右，雞場中禽流感和新城疫抗體效價均在免疫保護范圍內(nèi)，抗生素治療效果不佳。通過對病死雞進行剖檢，發(fā)現(xiàn)部分雞只肝臟腫大、出血，但并沒有出現(xiàn)大小不一的結(jié)節(jié)狀或塊狀腫瘤。依據(jù)臨床表現(xiàn)和剖檢病變，我們初步懷疑此次疫情可能是由禽HEV感染引發(fā)的雞BLS病。隨后我們通過對病死雞肝臟的病理學(xué)觀察和腸道內(nèi)容物的RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)肝臟呈現(xiàn)典型禽HEV感染雞只后引發(fā)的肝臟顯微病理學(xué)變化[11]，而腸道內(nèi)容物也擴增到禽HEV RNA。實驗室診斷驗證了此次疫情是由禽HEV感染引發(fā)。

圖3 禽HEV部分ORF2基因序列構(gòu)建的進化樹

禽HEV和禽白血病感染引發(fā)的臨床表現(xiàn)相似，但是通過對肝臟的剖檢病變和顯微病理學(xué)病變的觀察可對兩種病進行鑒別診斷。本次疫情剖檢雞只肝臟并未出現(xiàn)大小不一的結(jié)節(jié)狀或塊狀腫瘤，而顯微病理學(xué)也并未觀察到肝臟內(nèi)出現(xiàn)骨髓樣細胞瘤病變[12](瘤細胞胞漿內(nèi)有紅染顆粒)，說明此次疫情不是禽白血病。

同源性分析結(jié)果顯示，其(China 15-LN)與國內(nèi)的禽HEV參考序列(China 09-Z56，China 09-G57)的同源性為97.5%～99.6%，與部分國家的參考序列的同源性為77.9%～97.6%。構(gòu)建進化樹顯示，其與國內(nèi)禽HEV及歐洲的和美國部分分離株在同一進化分支上，同屬于禽HEV基因3型。上述結(jié)果說明，我國可能仍主要存在禽HEV基因3型的感染[7]，是否存在其他基因型仍需要進一步的流行病學(xué)調(diào)查。

通過臨床和實驗室診斷可以確定該雞場此次疫情是由禽HEV感染引發(fā)的。目前尚無特效疫苗和治療藥物，但是禽HEV屬于自限性疾病，產(chǎn)蛋量下降通常會持續(xù)3-10周，然后會恢復(fù)到接近正常水平，但是如果與其他病原混合感染可能誘發(fā)更嚴重的疾病表現(xiàn)。所以該雞場首先應(yīng)該及時清理傳染源，加強飼養(yǎng)管理，避免進一步感染健康雞，減少經(jīng)濟損失；其次減少應(yīng)激，避免雞群免疫力下降；最后雞群飼喂保肝護肝藥物，增強群體免疫力。

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2016-03-16

國家自然科學(xué)基金(31372464；31402233)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研(2452016048)

劉寶元(1985- )，男，博士生，主要從事分子病原學(xué)與獸醫(yī)免疫學(xué)的研究，E-mail:lby358891054@126.com

周恩民，E-mail:zhouem@nwsuaf.edu.com

S852.65

A

0529-6005(2016)11-0035-03