馮 柯 , 郭亞洲 , 張睿涵 , 薛瑞旭 , 王 歡 , 趙寶玉

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院 ， 陜西楊凌712100； 2.拉薩市動物疫病預防控制中心 ， 西藏拉薩851000)

藏橐吾小鼠急性毒性試驗

馮 柯1，2, 郭亞洲1, 張睿涵1, 薛瑞旭1, 王 歡1, 趙寶玉1

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院 ， 陜西楊凌712100； 2.拉薩市動物疫病預防控制中心 ， 西藏拉薩851000)

為了研究藏橐吾地上部分水提液對小鼠的急性毒性作用, 將100只體質量30±2 g昆明系小鼠隨機分成10組(灌胃6組, 腹腔注射4組), 每組10只, 雌雄各半。 灌胃給藥劑量為53.00～135.00 g/kg(以生藥量計), 灌胃量為1 mL/30 g, 分3次灌胃, 每次間隔4 h； 腹腔注射劑量為8.88～21.90 g/kg(以生藥量計), 注射量為0.8 mL/30g, 1次腹腔注射。 給藥后, 每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況, 連續(xù)觀察14 d, 記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應及病理剖檢變化, 統(tǒng)計死亡數, 用改良寇氏法計算LD50。 結果表明, 小鼠灌胃和腹腔注射的LD50分別為91.69 g/kg和15.75 g/kg, 95%可信限分別為83.10～101.16 g/kg和14.01～17.72 g/kg； 兩種染毒方式的中毒癥狀相似, 均出現(xiàn)精神沉郁、運動遲緩、食欲及飲水廢絕、呼吸頻率降低； 病理剖檢可見胃腸道臌氣, 肝臟、脾臟壞死。 結合中毒小鼠的臨床癥狀和病理剖檢變化, 綜合分析后認為藏橐吾有毒性, 主要損傷器官為胃腸道、肝臟和脾臟。

藏橐吾 ； 水提液 ； 灌胃 ； 腹腔注射 ； 急性毒性 ； 小鼠

藏橐吾(Ligulariarumicifolia)是菊科(Compositae)橐吾屬(Ligularia)的多年生草本植物，產于我國西藏東南部至東北部，生于海拔3 700～4 500 m的湖邊、林下、灌叢及山坡[1]。作為一味中藥，藏橐吾具有散寒、化痰、止咳等功效，常用于治療咳嗽痰喘、肺癆等癥[2]。藏橐吾植株高(40～100 cm)、葉片寬大(長19 cm，寬6～10 cm)，草原發(fā)生雪災后不易被積雪掩蓋，極易被饑餓動物采食，引起中毒。與藏橐吾同樣分布在青藏高原的黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)已造成青海貴南縣143頭牛、羊中毒[3]。同屬網脈橐吾(Ligulariadictyoneura)和牛蒡葉橐吾(Ligularialapathifolia)被認定為有毒植物[5]。目前，國內外尚無藏橐吾化學成分及毒性的相關報道。鑒于此，本試驗通過觀察藏橐吾水提液小鼠灌胃和腹腔注射的急性毒性，用改良寇氏法計算LD50，同時觀察小鼠的毒性反應及病理剖檢變化，以評價藏橐吾的毒性，為后續(xù)亞急性毒性試驗和毒性機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物樣品 藏橐吾地上部分全草2014年8月采集于西藏堆龍德慶縣(30°02′07.46″N；90°36′26.06″E)，曬干后粉碎，置于通風陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩Ｖ参飿吮居晌鞅鞭r林科技大學生命科學學院常朝陽研究員鑒定。

1.2 試驗動物 昆明系小鼠，雌雄各半，體質量 30±2 g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心購進。購進后進行7 d的喂養(yǎng)觀察，淘汰不健康小鼠。飼喂自制鼠糧。

1.3 試驗方法

1.3.1 水提液的制備 取一定質量的藏橐吾粉末，加10倍量的蒸餾水文火煎煮0.5 h，取上清液，過濾，如此重復3次，合并濾液，旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至生藥量為4.05 g/mL的溶液(此濃度為灌胃給藥的最大濃度)，加一定量的蒸餾水配置成不同生藥量的攻毒液。灌胃用的攻毒液，4 ℃保存?zhèn)溆?，腹腔注射用的攻毒液，高壓滅菌后? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 半數致死量(LD50)試驗 將健康小鼠隨機分成10組(灌胃6組，腹腔注射4組)，每組10只，雌雄各半。試驗前12 h、試驗后4 h禁食，但不限制飲水。根據預試驗結果，小鼠灌胃給藥劑量為 53.00～135.00 g/kg(以生藥量計)，劑間比為1∶0.83，灌胃量為1 mL/30g，分3次灌胃，每次間隔4h；小鼠腹腔注射劑量為8.88～21.90 g/kg(以生藥量計)，劑間比為1∶0.74，注射量為0.8 mL/30g，1次腹腔注射。給藥后，每天觀察小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應及病理剖檢變化，統(tǒng)計死亡數。

1.4 計算方法 用改良寇氏法計算LD50及95%可信限[6]。

2 結果

2.1 灌胃染毒結果

2.1.1 LD50及95%可信限結果 灌胃后觀察14 d，統(tǒng)計各個劑量組的死亡率(表1)，用改良寇氏法公式進行計算得出，藏橐吾地上部分水提液對小鼠灌胃的LD50為91.69 g/kg，95%可信限為 83.10～101.16 g/kg。

2.1.2 小鼠臨床癥狀及病理剖檢變化 隨著灌胃劑量的增大，小鼠出現(xiàn)中毒癥狀的時間也越早。小鼠中毒臨床癥狀不明顯，僅表現(xiàn)為對外界聲音刺激敏感，不喜動，食欲、飲水廢絕。死亡主要集中在灌胃后96 h內，耐過后的小鼠恢復正常。死亡小鼠的病理剖檢，主要表現(xiàn)為胃腸道局部臌氣；肝臟邊緣壞死；胸腔有積血；脾臟壞死；其余臟器未見明顯肉眼變化。攻毒14 d后對存活的小鼠用頸椎脫臼法處死并進行病理剖檢，臟器均未見明顯肉眼變化。

表1 小鼠灌胃急性毒性正式試驗結果

2.2 腹腔注射染毒結果

2.2.1 LD50及95%可信限結果 腹腔注射后觀察14 d，統(tǒng)計各個劑量組的死亡率(表2)，用改良寇氏法公式進行計算得出，藏橐吾地上部分水提液對小鼠腹腔注射的LD50為15.75 g/kg，95%可信限為14.01～17.72 g/kg。

表2 小鼠腹腔注射急性毒性正式試驗結果

2.2.2 小鼠臨床癥狀及病理剖檢變化 腹腔注射后，隨著攻毒劑量的增大，小鼠出現(xiàn)中毒癥狀的時間也越早，癥狀也越明顯。主要癥狀包括精神沉郁，不喜動，食欲、飲水廢絕，呼吸頻率降低。最高劑量組在臨死前出現(xiàn)亂竄、后肢抽搐等癥狀，多數在注射后6 min內死亡。其余劑量組表現(xiàn)出對外界聲音刺激不明顯，臨死前出現(xiàn)后肢麻痹、僵硬等癥狀。絕大部分死亡集中發(fā)生在注射后的24 h內，耐過的小鼠在出現(xiàn)精神沉郁后恢復正常。對死亡小鼠進行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)胃腸道局部臌氣，胃下部及小腸充血；心尖、肝臟、脾臟壞死；其余臟器未見明顯肉眼變化。攻毒14 d后對存活的小鼠用頸椎脫臼法處死并進行病理剖檢，臟器均未見明顯肉眼變化。

3 討論與結論

本試驗通過改良寇氏法計算得出，藏橐吾地上部分水提液小鼠灌胃的LD50為91.69 g/kg，95%可信限為 83.10～101.16 g/kg；腹腔注射的LD50為15.75 g/kg，95%可信限為14.01～17.72 g/kg。結合中毒小鼠的臨床癥狀和死后病理剖檢變化，綜合分析后認為藏橐吾有毒性，主要損傷器官為胃腸道、肝臟、脾臟。

通過兩種不同的染毒途徑可以看出，灌胃和腹腔注射的中毒癥狀相似，均出現(xiàn)精神沉郁、不喜動、食欲和飲水廢絕、呼吸頻率降低和胃腸道臌氣，肝臟、脾臟壞死等臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化。

本試驗初步研究發(fā)現(xiàn)，藏橐吾地上部分水提液小鼠灌胃的LD50為91.69 g/kg，95%可信限為 83.10～101.16 g/kg；腹腔注射的LD50為15.75 g/kg，95%可信限為14.01～17.72 g/kg。結合中毒小鼠的臨床癥狀和死后病理剖檢變化，綜合分析后認為藏橐吾有毒性，主要損傷器官為胃腸道、肝臟、脾臟。灌胃和腹腔注射的中毒癥狀相似，均出現(xiàn)精神沉郁、不喜動、食欲和飲水廢絕、呼吸頻率降低和胃腸道臌氣，肝臟、脾臟壞死等臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化。后續(xù)試驗可以進一步探究藏橐吾的主要有毒成分及其靶器官。

[1] 傅坤俊,張振萬,何善寶,等.中國植物志.第77(2)卷[M].北京:科學出版社, 1993:47.

[2] 中國藥材公司.中國中藥資源志要[M].北京:科學出版社,1994:1318.

[3] 林永明.牛羊黃帚橐吾草中毒癥的診治[J].中國草食動物,2011,3:74-75.

2015-11-05

農業(yè)部“十二五”公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201203062)

馮柯(1982- )，男，碩士，主要從事動物中毒病與毒理學研究，E-mail: John3376@qq.com

趙寶玉，E-mail:zhaobaoyu12005@163.com

S859.87

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0529-6005(2016)11-0113-02