周傳鐸 ， 趙 然， 金藝鵬， 周雅楠 ， 李曉曉 ， 林德貴， 張 迪

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑偵總隊警犬技術(shù)支隊 ， 北京大興102614)

北京地區(qū)警犬皮膚偽中間型葡萄球菌藥敏試驗及耐藥基因篩查

周傳鐸1,2， 趙 然2， 金藝鵬1， 周雅楠1， 李曉曉1， 林德貴1， 張 迪1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193 ； 2.北京市公安局刑偵總隊警犬技術(shù)支隊 ， 北京大興102614)

采用紙片擴散法對北京地區(qū)警犬皮膚分離出的23株偽中間型葡萄球菌進行藥物敏感性試驗， 并用PCR擴增技術(shù)進行相關(guān)耐藥基因篩查。 結(jié)果顯示： 23株偽中間型葡萄球菌對頭孢西丁、 阿米卡星、 阿莫西林-克拉維酸、 頭孢曲松、 氟苯尼考全部敏感， 對青霉素G耐藥性最高， 為52.17%； 耐藥基因篩查中， 3株未檢出耐藥基因， 占13.04%； 耐藥基因中，linA/linA’檢出率最高， 為47.83%； 耐藥基因譜型以aacA-aphD、linA/linA′為主， 占17.39%。

偽中間型葡萄球菌 ； 警犬 ； 耐藥基因 ； 膿皮病

現(xiàn)代研究表明，偽中間型葡萄球菌為犬膿皮病的最主要致病菌[1]，而隨著抗菌藥物的大量使用，已有越來越多的細菌出現(xiàn)耐藥表型[1-2]。為加強對北京地區(qū)警犬膿皮病的進一步了解，本試驗對從北京警犬皮膚分離的23株偽中間型葡萄球菌進行藥物敏感性試驗及多種耐藥基因篩查，為其流行病學(xué)研究、臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測樣本 從北京警犬體表皮膚分離的23株偽中間型葡萄球菌，其中膿皮病患處分離得到17株，健康犬體表分離得到6株。

1.2 試劑與設(shè)備 細菌培養(yǎng)所用各種培養(yǎng)基,購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；藥敏試紙片，分別購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司及北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；培養(yǎng)基及其他試劑均按產(chǎn)品說明書或常規(guī)方法配制；標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)藥理實驗室提供；DNA Marker，購自天跟生化科技(北京)有限公司；2 * EasyTaqSupper Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物設(shè)計參照相關(guān)文獻[3,4]，由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成，具體信息見表1。

表1 PCR檢測耐藥基因引物序列、擴增片段長度

1.3 藥敏試驗 常規(guī)方法對菌株進行培養(yǎng)，并采用紙片擴散法進行藥物敏感性試驗。結(jié)果判定依CLSI(2015修訂版)進行。

1.4 耐藥基因篩查 (1)采用水煮法[5]提取細菌DNA；(2)在冰浴中冷啟動Taq酶及上下游引物；(3)先后按照Taq酶、滅菌蒸餾水、各目標引物、水煮法提取的DNA的順序加入至PCR離心管中，低速旋轉(zhuǎn)混勻。以滅菌雙蒸水為陰性對照組。具體加樣量為Taq酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，樣本DNA 2 μL，其他由滅菌雙蒸水8.5 μL補充，構(gòu)建25 μL反應(yīng)體系；(4)PCR操作依表2標注的條件進行；(5)電泳時，加入DL100 Marker作為參照(M)，最后一孔(25孔)為陰性對照組(C)。將陽性條帶的PCR原液送到測序公司測序，得到的序列在NCBI網(wǎng)站中進行比對，并判讀結(jié)果。

表2 PCR運行條件

注： a：預(yù)變性條件94 °C，3 min；延伸階段條件72 °C，4 min； b：預(yù)變性條件 94 °C，10 min；延伸階段條件72 °C，10 min

2結(jié)果

2.1 偽中間型葡萄球菌耐藥情況 試驗中，23株偽中間型葡萄球菌對頭孢西丁、阿米卡星、阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松、氟苯尼考全部敏感，對青霉素G耐藥性最高，為52.17%，其他具體結(jié)果見表3。

表3 非全部敏感偽中間型葡萄球菌耐藥情況

2.2 偽中間型葡萄球菌耐藥基因攜帶情況 對23株北京地區(qū)警犬皮膚采集的偽中間型葡萄球菌常見耐藥基因攜帶情況的檢測結(jié)果(見圖1-5)顯示，未檢出耐藥基因的菌株共3株，占13.04%；其余20株菌均檢出耐藥基因，其中l(wèi)inA/linA’檢出率最高，為47.83%；aacA-aphD占比39.13%，次之；ermB、msrB和tetK分別為 34.78%、13.04%和8.70%；其他耐藥基因未檢出。耐藥基因譜型中，檢出aacA-aphD、ermB、tetK、linA/linA’譜型1株，占3.35%；檢出aacA-aphD、msrB、linA/linA’譜型1株；aacA-aphD、linA/linA’譜型4株。具體結(jié)果見表4。

表4 偽中間葡萄球菌耐藥基因譜型檢出情況

圖1 aacA-aphD基因檢測結(jié)果

圖2 ermB基因檢測結(jié)果

圖3 tetK基因檢測結(jié)果

圖4 msrB基因檢測結(jié)果

圖5 linA/linA’基因檢測結(jié)果注：M：DL-100 Marker；C：陰性對照；1～23：偽中間型葡萄球菌提取DNA(圖1-5僅顯示陽性結(jié)果，部分陰性結(jié)果及陰性對照未列出)

3 分析與討論

3.1 耐藥基因與細菌藥物敏感性之間的關(guān)系mecA基因，為一種外源性基因，可與葡萄球菌基因結(jié)合后，降低藥物對細菌細胞壁合成的阻礙作用，從而在臨床表型方面表現(xiàn)為對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥[6]。mecA為檢測耐甲氧西林葡萄球菌的可靠方法。本試驗中，未檢出該基因，且所有試驗菌均對頭孢西丁敏感，可以推定試驗菌中無耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌。但試驗中，有52.17%菌株對青霉素G耐藥，因此提示在選擇β-內(nèi)酰胺類藥物進行治療時，仍要慎重。

aacA-aphD為氨基糖苷類抗菌藥物耐藥基因，其主要是通過編碼氨基糖苷鈍化酶作用于藥物特異的氨基或羥基上，使藥物難與細菌的核糖體結(jié)合、藥物攝入的能量依賴階段Ⅱ不能進行，從而導(dǎo)致耐藥[7-8]。本試驗中，共從9株偽中間型葡萄球菌中篩選出aacA-aphD基因，占比39.13%，但藥敏試驗結(jié)果顯示，23株細菌對阿米卡星均敏感。楊靜[2]試驗中耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌100%攜帶aacA-aphD基因，但對慶大霉素表現(xiàn)耐藥的菌株只有39.4%。Perreten[9]等的試驗中，亦有19株菌出現(xiàn)類似情況。以上信息均提示偽中間型葡萄球菌對于aacA-aphD基因可能存在基因耐藥、表型不耐藥的情況。

Tet類基因為四環(huán)素類藥物耐藥基因，通過阻止氨酰tRNA與核糖體結(jié)合位點(A)的結(jié)合來阻止菌體蛋白合成而發(fā)揮作用。tetM基因可介導(dǎo)細菌則對所有四環(huán)素類藥物耐藥，而tetK基因則僅致細菌四環(huán)素耐藥，但對多西環(huán)素等其他藥物敏感，且tetK在甲氧西林敏感葡萄球菌中存在較多，而tetM基因則普遍存在于耐甲氧西林葡萄球菌中[10-11]。本試驗，2株菌檢出tetK基因，該兩株菌均對四環(huán)素耐藥、對多西環(huán)素中介，所有菌株菌未檢出tetM基因，與先前論述相符；另5株菌對四環(huán)素耐藥、3株菌對多西環(huán)素耐藥，其可能存在其他耐藥基因型，或為表型耐藥而無基因耐藥。

葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類藥物與鏈陽菌素類藥物這三類通過抑制細菌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗菌作用的藥物產(chǎn)生耐藥的機制主要有兩種。一類由erm類基因介導(dǎo)，編碼核糖體甲基化酶，催化23S rRNA的核糖體形態(tài)改變，降低抗生素與細菌核糖體靶位的親和力，從而導(dǎo)致耐藥。該類又可分為誘導(dǎo)型和組成型。誘導(dǎo)型為erm基因受藥物誘導(dǎo)而表達，其表型為對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥，但對克林霉素敏感；組成型則為erm基因的穩(wěn)定表達，對紅霉素及林可霉素均耐藥[12]。另一類為由msr介導(dǎo)，編碼依賴于ATP的泵出蛋白，將抗生素泵出細胞，保持細胞內(nèi)抗生素的低濃度水平，可介導(dǎo)細菌對大環(huán)內(nèi)酯類和鏈陽菌素B同時耐藥，而對林可霉素敏感[13]。linA/linA′基因介導(dǎo)細菌產(chǎn)生林可霉素核苷轉(zhuǎn)移酶滅活林可霉素和克林霉素，但體外僅對林可霉素高耐，而對克林霉素可能表現(xiàn)敏感[4]。本試驗中，篩查出攜帶ermB基因的菌株8株，但與之對應(yīng)僅有3株表現(xiàn)為克林霉素中介，其余為敏感，推測分離所得ermB均為誘導(dǎo)型；篩查出攜帶msrB基因菌株3株，均表現(xiàn)為紅霉素耐藥；攜帶linA/linA′基因11株，其中6株表現(xiàn)對克林霉素耐藥、2株中介、3株敏感。存在未檢出相應(yīng)耐藥但表現(xiàn)耐藥的情況，可對其采用其他耐藥基因進行進一步篩查。

3.2 偽中間型葡萄球菌攜帶的耐藥基因譜型 Schwarz[14]等在德國采集偽中間型葡萄球菌的耐藥基因譜型為mecA、aacA/aphD、tetK，而楊靜[2]針對北京耐甲氧西林偽中間型葡萄球的篩查結(jié)果顯示，其耐藥基因譜型為mecA、ermB、tetK、aacA-aphD。本試驗中，23 株偽中間型葡萄球菌中未篩查到mecA基因，主要存在的耐藥基因譜型為linA/linA’、aacA-aphD，占17.39%。

[1] Karen H R, Alexander H W. 小動物皮膚病診療彩色圖譜(第2版)李國清譯[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2014：196-211.

[2] 楊靜. 犬化膿感染病原菌耐藥性調(diào)查及耐甲氧西林假中間型葡萄球菌流行病學(xué)研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2011.

[3] Strommenger B, Kettlitz C, Werner G,etal. Multiplex PCR assay for simultaneous detection of nine clinically relevant antibiotic resistance genes inStaphylococcusaureus[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41: 4089-4094.

[4] Lina G, Quaglia A, Reverdy M E,etal. Distribution of genes encoding resistance to macrolides, lincosamides, and streptogramins amongstaphylococci[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1999, 43: 1062-1066.

[5] Lima D C N E, Dos S K R N, Mondino P J J,etal. Detection of ileS-2 gene encoding mupirocin resistance in methicillin-resistantStaphylococcusaureusby multiplex PCR[J]. Diagnostic Microbiology and Infected Disease, 1999, 34: 77-81.

[6] Ryffel C, Kayser F, Berger B B. Correlation between regulation of mecA transcription and expression of methicillin resistance instaphylococci.[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1992, 36：25-31.[7] Fluit A C, Visser M R, Schmitz F J. Molecular detection of antimicrobial resistance[J]．Clin Microbiol Rev, 2001, 14 (4): 836-871.

[8] Martineau F, Picard F J, Lansac N,etal．Correlation between the resistance genotype determined by mul-tiplex PCR assays and the antibiotic susceptibility patterns ofStaphylococcusanreusandStaphylococcusepidermidis[J]．Antimierob Agents Chemother, 2000, 4(2): 231-238.

[9] Perreten V, Kadlec K, Schwarz S,etal. Clonal spread of methicillin-resistantStaphylococcuspseudintermediusin Europe and North America: an international multicentre study[J]. Journal ofAntimicrobial Chemotherapy, 2010, 65: 1145-1154.

[10] Schwartz B S, Graber C J, Diep B A,etal. Doxycycline, not minocycline, induces its own resistance in multi-drugresistant, community-associated methicillin-resistantStaphylococcusaureusclone[J]. Clinical Infectious Diseases, 2009，48: 1483-1484.

[11] Trzcinski K, Cooper B S, Hryniewicz W,etal. Expression of resistance to tetracyclines in strains of methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy， 2000, 45: 763-770.

[12] Fiebelkorn K R, Crawford S A, McElmeel M L,eta1. Practical disk difusion method for detection of inducible clindamycin resistance inStaphylococcusaureusand coagulase-negativeStaphylococci[J]．J ClinMicrobiol, 2003, 41(10) : 4740-4744.

[13] Leclercq R．Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications[J]．Clin Infect Dis, 2002, 34(4) :482-492.

[14] Schwarz S, Kadlec K, Strommenger B. Methicillin-resistantStaphylococcusaureusandStaphylococcuspseudintermediusdetected in the BfT-Germ Vet monitoring programme 2004-2006 in Germany[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2008, 61: 282-285.

Antibacterial Sensitive Test and Drug-resistant Genetic Screening forStaphylococcusPseudintermediusfrom the Skins of Police Dogs in Beijing Area

ZHOU Chuan-duo1,2, ZHAO Ran2, JIN Yi-peng1, ZHOU Ya-nan1,LI Xiao-xiao1, LIN De-gui1, ZHANG Di1

(1.College of veterinary medicine,China Agriculture University, Beijing 100193, China;2. Detachment of police dogs techniques ,Beijing Criminal Investigation Department,Beijing 102614, China)

The paper disk diffusion was used for testing the antibacterial sensitivity of 23staphylococcuspseudintermediusstrains from the skins of police dogs in Beijing area, while drug-resistant genetic screening was taken by PCR method. All bacterial strains were sensitive to the drugs of cefoxitin, amikacin, amoxicillin-， clavulanic acid, ceftriaxone and florfenicol, while the highest rate of drug resistant was to penicillin G at 52.17%. Of 23 strains, 3 were detected as negative in drug-， resistant gene. In the drug-， resistant genetic,linA/linA’ was with the highest prevalence as 47.83%. TheaacA-aphDandlinA/linA’ took amount of 17.39% in all drug-， resistant genetic typing.

staphylococcuspseudintermedius, policedog, drug resistance gene, pyodermia

ZHANG Di

2015-11-16

周傳鐸(1982-),男，獸醫(yī)師，博士，從事警犬疾病防治工作，E-mail: zthxc@163.com

張迪，E-mail: dzhangdvm@cau.edu.cn

S858.292

A

0529-6005(2016)11-0100-04