于淑倩,隋小芳,王鳳玲,苑露丹,劉 宇,張培培

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

低表達(dá)miR-338-3p誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞EOMA炎癥反應(yīng)

于淑倩,隋小芳*,王鳳玲,苑露丹,劉 宇,張培培

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年病科，黑龍江 佳木斯154002)

目的 研究miR-338-3p在內(nèi)皮細(xì)胞EOMA炎癥反應(yīng)中的作用。方法 用TNF-α 20 ng/ml處理內(nèi)皮細(xì)胞系EOMA 24 h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-338-3p、黏附因子VCAM-1和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平，Western blot分析ERK及p38 MAPK信號通路活性；構(gòu)建miR-338-3p低表達(dá)腺病毒載體(miR-338-3p inhibitor)，感染EOMA細(xì)胞48 h，PCR檢測miR-338-3p、VCAM-1及ICAM-1 mRNA表達(dá)水平，Western blot分析ERK及p38 MAPK信號通路活性。結(jié)果 TNF-α 20 ng/ml處理EOMA細(xì)胞 24 h miR-338-3p表達(dá)水平下降，ERK及p38蛋白磷酸化水平升高，VCAM-1及ICAM-1 mRNA表達(dá)水平升高；miR-338-3p inhibitor 感染EOMA細(xì)胞48 h，miR-338-3p表達(dá)水平明顯降低，ERK及p38蛋白磷酸化水平明顯升高，黏附因子VCAM-1及ICAM-1 mRNA基因表達(dá)水平升高。結(jié)論 在內(nèi)皮細(xì)胞EOMA炎癥模型中，TNF-α下調(diào)miR-338-3p表達(dá)水平；低表達(dá)miR-338-3p激活MAPK信號通路活性，增強(qiáng)黏附因子表達(dá)水平，誘導(dǎo)EOMA細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

miR-338-3p;內(nèi)皮細(xì)胞；炎癥反應(yīng)；黏附因子

(ChinJLabDiagn,2016,20:2002)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病[1]。研究表明，miRNA參與調(diào)控許多病理生理學(xué)機(jī)制如炎癥炎介質(zhì)產(chǎn)生、細(xì)胞黏附、增殖、凋亡、脂質(zhì)攝取與流出等，并參與調(diào)控炎癥信號通路活性，對動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展有著重要的調(diào)節(jié)作用[2,3]。近年來有報(bào)道指出miR-338-3p與糖尿病心肌病有關(guān)[4]，并參與腫瘤細(xì)胞分化、增殖及遷徙[5]。然而miR-338-3p是否參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)尚未見報(bào)道。因此，研究miR-338-3p在血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制，為基因靶向治療動(dòng)脈硬化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

EOMA細(xì)胞(小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞珠，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫)；H-DMEM 培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；FBS胎牛血清(Hyclone公司)；TNF-α (Epitomics公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG相關(guān)抗原抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；miR-338-3p低表達(dá)腺病毒載體(AD-338-3p inhibitor)(構(gòu)建與純化由上海吉?jiǎng)P科技有限公司完成)；SYBR Premix Ex Taq II(日本TAKARA)；Rabbit GAPDH Antibody(美國CST)；磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(p-ERK)抗體、ERK抗體、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶抗體及p38抗體均購于美國CST。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

EOMA細(xì)胞用含10%胎牛血清FBS的高糖培養(yǎng)基H-DMEM 于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 檢測miR-338-3p在內(nèi)皮損傷中的表達(dá)

將EOMA細(xì)胞接種于六孔板中，分別設(shè)為對照組和TNF-α處理組。對照組正常培養(yǎng)，TNF-α處理組用TNF-α 20 ng/ml處理內(nèi)皮細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄miRNA合成cDNA，用SYBR Green熒光定量試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測miR-338-3p表達(dá)，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行比較，結(jié)果用2-ΔΔct計(jì)算相對表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)如下：

引物名稱反轉(zhuǎn)錄引物序列5′?3′miR?338?3pGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT?TCGCACTGGATACGACcaacaaU6GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT?TCGCACTGGATACGACAAATATG

引物名稱PCR引物序列5′?3′miR?338?3pGCGTCCAGCATCAGTGATTU6GCGCTCGTGAAGCGTTCReverseGTGCAGGGTCCGAGGT

1.4 觀察內(nèi)皮損傷后黏附因子表達(dá)和MAPK信號通路變化

上述細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄cDNA用PCR檢測黏附因子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)水平。提取上述兩組細(xì)胞總蛋白，Western blot 分析ERK及p38 MAPK信號通路變化。VCAM-1和ICAM-1及內(nèi)參18S的引物設(shè)計(jì)如下：

引物名稱PCR引物序列5′?3′VCAM?1ForwardCACTTGTGGAAATGTGCCCGVCAM?1ReverseTCACACTCGTATATGCCGGCICAM?1ForwardTTTTCAGCTCCGGTCCTGACICAM?1ReverseCCGCTCAGAAGAACCACCTT18sForwardGGAAGGGCACCACCAGGAGT18sReverseTGCAGCCCCGGACATCTAAG

1.5 低表達(dá)miR-338-3p對內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)信號通路變化

構(gòu)建miR-338-3p低表達(dá)腺病毒載體(338i)和陰性對照病毒(NCi)，分別感染EOMA細(xì)胞48小時(shí)。收集細(xì)胞，PCR 檢測miR-338-3p表達(dá)及黏附因子VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表達(dá)變化，Western blot分析ERK及p38 磷酸化水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以GraphPad Prism 5.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，95%可信區(qū)間，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 下調(diào)EOMA細(xì)胞中miR-338-3p的表達(dá)水平，激活MAPK信號通路活性，引起炎癥反應(yīng)

與對照組比較，TNF-ɑ處理EOMA細(xì)胞24小時(shí)miR-338-3p的表達(dá)水平明顯降低(圖1 A)，同時(shí)黏附因子VCAM-1及ICAM-1 mRNA 表達(dá)水平升高(圖1 B、C)，Western blot 分析p-ERK及p-p38相對表達(dá)水平較對照組升高明顯(圖1 D)。結(jié)果表明，TNF-ɑ降低EOMA細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)水平，升高ERK/p38磷酸化水平，并增加黏附因子表達(dá)水平，引起炎癥反應(yīng)，miR-338-3p可能參與其中。

2.2 低表達(dá)miR-338-3p 增強(qiáng)MAPK信號通路活性，上調(diào)黏附因子表達(dá)，誘導(dǎo)EOMA細(xì)胞炎癥反應(yīng)

用miR-338-3p 低表達(dá)腺病毒及其陰性對照病毒分別轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞EOMA 48小時(shí)，結(jié)果顯示，與對照組比較miR-338-3p 表達(dá)水平明顯下降約40%(圖2 A)，黏附因子VCAM-1及ICAM-1的表達(dá)水平明顯升高(圖2 B、C)；同時(shí)Western blot分析p-ERK及p-p38 相對表達(dá)量明顯升高(圖 2 D)。結(jié)果表明，低表達(dá)miR-338-3p能夠加強(qiáng)MAPK信號通路活性，增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子VCAM-1及ICAM-1 mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

A.miR-338-3p表達(dá)水平；B.黏附因子VCAM-1表達(dá)水平；C.黏附因子ICAM-1表達(dá)水平；D.ERK/p38 MAPK 信號通路蛋白表達(dá)水平(n=3,*P<0.05,**<0.01))

圖1 TNF-ɑ 誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷產(chǎn)生炎癥反應(yīng)

A.miR-338-3p表達(dá)水平；B.黏附因子VCAM-1表達(dá)水平；C.黏附因子ICAM-1表達(dá)水平；D.ERK/p38 MAPK信號通路蛋白表達(dá)變化(n=3,*P<0.05,**<0.01,***<0.001)

圖2 低表達(dá)miR-338-3p(miR-338-3p inhibitor)促進(jìn)EOMA細(xì)胞炎癥反應(yīng)

3 討論

據(jù)報(bào)道，心血管疾病在亞洲、非洲、南美等發(fā)展中國家的發(fā)病率高于5%，然而北美、歐洲、澳大利亞等發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率不足3%，預(yù)測到2020年，心血管疾病死亡率居全球第一[6]。與心血管疾病最直接相關(guān)便是動(dòng)脈粥樣硬化。動(dòng)脈粥樣硬化是首先發(fā)生于動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮細(xì)胞的一種并發(fā)炎癥性疾病[7]，各種危險(xiǎn)因素如糖尿病、高血壓、血脂異常、肥胖、吸煙等都能導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[6]。研究證實(shí)一些炎癥介質(zhì)如IL-6、黏附因子ICAM-1、單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1及氧化應(yīng)激參與炎癥反應(yīng)發(fā)生[8]。因此，探究內(nèi)皮損傷炎癥反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制，將有助于對動(dòng)脈硬化及心血管疾病的認(rèn)識(shí)。

炎性因子是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素。巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)和IL-6[9]。TNF-α能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，降低NO，增加VCAM-1表達(dá)水平[10]，激活p38MAPK/NF-КB信號通路活性[11]，導(dǎo)致細(xì)胞黏附性增強(qiáng)、炎性細(xì)胞趨化，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

一些miRNA如miR-181b[12]、miR-146a及miR-146b通過抑制抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控動(dòng)脈硬化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理內(nèi)皮細(xì)胞，miR-338-3p的表達(dá)水平明顯降低，ERK及p38磷酸化水平明顯升高，黏附因子VCAM-1及ICAM-1的表達(dá)增多。結(jié)果表明TNF-α能夠抑制EOMA細(xì)胞中miR-338-3p的表達(dá)水平，且TNF-α能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，提示miR-338-3p可能參與TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的炎癥反應(yīng)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)EOMA細(xì)胞中低表達(dá)miR-338-3p能夠增強(qiáng)ERK及p38蛋白磷酸化水平，升高細(xì)胞黏附因子VCAM-1及ICAM-1表達(dá)水平，結(jié)果表明低表達(dá)miR-338-3p能夠誘導(dǎo)EOMA細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

綜上所述，TNF-α能抑制EOMA細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)，且低表達(dá)miR-338-3p能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本文揭示了miR-338-3p可能參與調(diào)控血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，為動(dòng)脈粥樣硬化提供新的治療靶點(diǎn)和方向，但其具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探討。

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MiR-338-3p low expression promotes inflammatory response signaling pathway in EOMA cells

YUShu-qian,SUIXiao-Fang*,WANGFeng-ling,etal.

(DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofJiamusiUniversity,Jiamusi154002，China)

Objective To study the role of miR-338-3p in the inflammatory response of endothelial cell line EOMA.Methods EOMA cells were treated with TNF-α 20 ng/ml,using Real-time PCR to detect the expression levels of miR-338-3p,adhesion factor VCAM-1 and ICAM-1,and western blot analysis of ERK and p38 MAPK signaling pathway activity.In order to decrease the expression of miR-338-3p,EOMA cells were transfected with miR-338-3p inhibitor for 48 hours.The expression of miR-338-3p and adhesion factor,such as VCAM-1 and ICAM-1 were detected by Real-time PCR.The protein associated with MAPK signaling pathway in this study were analysis of western blot.Results The expression of miR-338-3p was reduced and adhesion factor VCAM-1 and ICAM-1 expression was enhanced by endothelial cells EOMA treated with TNF-α 20 ng/ml for 24 hours.Western blot analysis of ERK/p38 MAPK signaling pathway activity was enhanced in endothelial cells induced by TNF-α.Down regulation of miR-338-3p expression was accompanied by enhancing expression of VCAM-1 and ICAM-1,and activating MAPK signaling pathway activity in endothelial cells EOMA infected with miR-338-3p inhibitor.Conclusion The expression of miR-338-3p was down regulated in EOMA cells induced treated with TNF-α;miR-338-3p inhibitor induced the inflammatory response of endothelial cells by activating the MAPK signaling pathway and enhancing the expression of adhesion molecules.

miR-338-3p；endothelial cells；inflammatory response；adhesion factor

黑龍江省自然基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：H2015076)； 佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：YZ2016_020)

1007-4287(2016)12-2002-04

R392

A

于淑倩(1987-)，在讀碩士研究生；隋小芳(1976-)，女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事老年心血管疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

2016-04-21)

*通訊作者