樊 婷

(湖北省隨州市中心醫(yī)院，湖北 隨州 441300)

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維生素D對急性白血病多重耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)耐藥機制探討①

樊 婷

(湖北省隨州市中心醫(yī)院，湖北 隨州 441300)

目的：探討維生素D對急性白血病多重耐藥細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)耐藥機制。方法:以MTT法獲取無毒濃度維生素D，開展?jié)舛纫蕾噷嶒?；?jīng)流式細(xì)胞儀監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素以及P-糖蛋白(P-gp)表達(dá)水平；以實時熒光定量PCR(Real～time PCR)測定細(xì)胞內(nèi)mdrl及mdpl mRNA表達(dá)變化；以生化法測定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽(GSH)水平。結(jié)果:維生素D可使耐藥細(xì)胞耐藥倍數(shù)下降，且有劑量依賴；維生素D干預(yù)Jurcat/ADR48h后，促使細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度上升，抑制P-gP以及mdrl、mrpl基因的表達(dá)；維生素D使Jurcat與Jurcat/ADR細(xì)胞內(nèi)GSH的水平顯著降低。結(jié)論:維生素D對于Jurcat/ADR耐藥逆轉(zhuǎn)顯著。維生素D參與抑制細(xì)胞表面的P-gp表達(dá)水平，抑制mdrl、mrpl mRNA表達(dá)及使細(xì)胞內(nèi)GSH水平降低，間接提高細(xì)胞內(nèi)的化療藥物濃度，實現(xiàn)對白血病的有效治療。

維生素D； 白血??； 多重耐藥

在目前白血病臨床治療中，聯(lián)合化療是最常見的治療方案，能使白血病患者的生存期得以延長。然而，化療過程中出現(xiàn)原發(fā)耐藥患者約占15%～30%，經(jīng)化療后完全緩解的患者繼發(fā)耐藥約占60%～80%[1]，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡。多重耐藥(MDR)成為急性白血病化療失敗導(dǎo)致復(fù)發(fā)的首要原因[2]。傳統(tǒng)化療藥干預(yù)MDR腫瘤細(xì)胞的臨床效果不顯著，導(dǎo)致化療失敗，急性白血病治療也是如此[3]。本研究以維生素D對急性白血病細(xì)胞株進行耐藥逆轉(zhuǎn)研究，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 細(xì)胞株及其培養(yǎng):建立人急性T淋巴細(xì)胞白血病(ALL)耐藥細(xì)胞株Jurcat/ADR。購自上海拜力生物科技有限公司的普通Jurcat細(xì)胞株。Jurcat/ADR細(xì)胞培養(yǎng)體系根據(jù)上海拜力生物科技有限公司的培養(yǎng)指標(biāo)加入終質(zhì)量濃度為0．5mg/L的多柔比星(doxorubicin，ADM)，進行為期2周的無藥培養(yǎng)。

1．1．2 試劑:維生素D(上海撫生生物科技有限公司，批號：V9325，1g)；歐洲胎牛血清；注射用鹽酸柔紅霉素；RPMI 1640；鼠抗人P-gP單克隆抗體；cDNA第一鏈合成試劑盒、RNA提取試劑盒；GSH試劑盒；引物包括：mdrl上游引物5’-CCCAT-CATTGCAATAGCAGG-3’，下游引物為5’-GTFCAAACTTCTGCTCCTCA-3’，片段長157bp；mrpl上游引物為5’-GGACCTGGACTTCGTTCTCA-3’，rmpl下游引物5’-CGTC-CAGACTTCTTCATCCG-3’，片段長292bp。

1．2 方法:濃度依賴實驗在采用MTT法篩選維生素D的無毒劑量，其抑制率不應(yīng)大于10%的前提下，分為以下組：實驗組：化療藥物柔紅霉素(daunorubicin，DNR)、多柔比星(DOX)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Arac )、長春新堿(vincristine，VCR)聯(lián)合維生素D，每個樣本加注10ul維生素D維持其質(zhì)量濃度分別達(dá)到10-3mg/L(A)、10-4mg/L(B)、10-5mg/L(C)、10-6mg/L (D)4個組。每組每孔均加入5ulADR(DNR、DOX、Arac、VCR)，保證其終質(zhì)量濃度達(dá)到50ul/L。對照組：單純化療藥物組(DNR、DOX、Arac、VCR)：細(xì)胞懸浮液加注75uL化療藥物。Jurcat及Jurcat/ADR加入10-3mg/L(A-s)、10-4mg/L(B-s)、10-5mg/L(C-s)、10-6mg/L(D-s)滴度的Vit D作為基線，對維生素D聯(lián)合化療藥物對Jurcat及Jurcat/ADR的耐藥狀況進行參照。采用Real-time PCR檢測mdrl mRNA、mrpl mRNA的表達(dá)情況，計算其相對表達(dá)量，每個實驗設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值。蛋白分析法檢測GSH，計算各組細(xì)胞GSH含量，每個實驗設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值。

2 結(jié) 果

2．1 維生素D的耐藥逆轉(zhuǎn)及濃度依賴實驗:伴隨Vit D質(zhì)量濃度的遞增，Jurcat/ADR耐藥倍數(shù)降低，推測維生素D逆轉(zhuǎn)了Jurcat/ADR對DNR、DOX、Arac、VCR的耐藥性(P<0．05)，維生素D對逆轉(zhuǎn)多柔比星的耐藥效應(yīng)最為顯著，逆轉(zhuǎn)柔紅霉素的耐藥效應(yīng)顯著，但不及多柔比星。見表1。

表1 維生素D聯(lián)合DNR、DOX、Arac、VCR48h后Jurcat及Jurcat/ADR的耐藥逆轉(zhuǎn)狀況

2．2 Vit D對Jurcat/ADR內(nèi)mdrl，mrpl mRNA表達(dá)的影響:無毒不同滴度Vit D作用JurcaL/ADR細(xì)胞株48h后，經(jīng)Real-time PCR儀擴增，實驗結(jié)果提示，實驗組mdrl、mrpl mRNA表達(dá)顯著低于對照組，且隨Vit D質(zhì)量濃度遞增，mdrl、mrpl mRNA表達(dá)隨之降低，呈現(xiàn)出劑量依賴性。見表2。

表2 Vit D對Jurcat/ADR內(nèi)mdrl，mrpl mRNA表達(dá)的影響

注:A-r代表A-DNR，A-DOX，A-Arac，A-VCR的平均值，B-r、C-r、D-r以此類推。體現(xiàn)不同滴度Vit D對Jurcat/ADR內(nèi)mdrl，mrpl mRNA表達(dá)的影響。我們可通過表2看到，Vit D濃度越高，抑制Jurcat/ADR內(nèi)mdrl，mrpl mRNA表達(dá)作用越明顯。

2.3 Vit D對Jurcat、Jurcat/ADR細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響:Jurcat/ADR細(xì)胞株處于不同滴度Vit D中，隨Vit D滴度遞增能使Jurcat/ADR內(nèi)GSH水平受到顯著影響，抑制GSH藥物外排泵可能促進了逆轉(zhuǎn)Jurcat/ADR細(xì)胞的耐藥性，見表3。

表3 Vit D對Jurcat、Jurcat/ADR細(xì)胞內(nèi)GSH影響

3 討 論

兒童白血病中90%以上為急性白血病，慢性白血病僅占3%～5%.主要是慢性粒細(xì)胞白血病[4]。兒童白血病在任何年齡均可發(fā)病，但以學(xué)齡前期和學(xué)齡期兒童多見；男性發(fā)病率高于女性。聯(lián)合化療緩解了兒童ALL，然而，介于MDR腫瘤細(xì)胞的影響，大部分傳統(tǒng)化療藥物無法對MDR腫瘤細(xì)胞起到治療作用，導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)，因此尋找安全有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑極具臨床意義。

臨床報告顯示，長時間維生素 D的缺乏可導(dǎo)致個體患肺癌、胰腺癌和皮膚癌等多種癌癥，或出現(xiàn)精神抑郁、心血管疾病、糖尿病等癥狀。研究結(jié)果顯示ATRA與維生素D這2種藥物在化療過程中能有效增加MDR腫瘤細(xì)胞敏感性，同時減輕患者化療后不良反應(yīng)的發(fā)生幾率。然而維生素D對于急性白血病耐藥細(xì)胞株是否存在耐藥逆轉(zhuǎn)仍需實驗驗證。

本研究認(rèn)為維生素D對多柔比星、阿糖胞苷、柔紅霉素、長春新堿等不同化療藥物作用下的Jurcat/ADR存在耐藥逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，且對逆轉(zhuǎn)多柔比星的耐藥效應(yīng)最強，對逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺的效應(yīng)較差。維生素D的水平越高逆轉(zhuǎn)效應(yīng)越強，體現(xiàn)了明顯的藥物濃度依賴性。耐藥基因mRNA表達(dá)實驗提示Jurcat/ADR細(xì)胞株中無明顯變化，在Jurcat/ADR細(xì)胞株中mrpl mRNA的表達(dá)隨著維生素D質(zhì)量濃度的增加而減低。維生素D對Jurcat/ADR細(xì)胞表面P-gP水平的影響實驗發(fā)現(xiàn)隨著維生素D質(zhì)量濃度的增加可降低。本實驗發(fā)現(xiàn)隨著維生素D質(zhì)量濃度的增加可影響Jurcat/ADR細(xì)胞內(nèi)的GSH水平，也存在藥物濃度依賴性，推測逆轉(zhuǎn)Jurcat/ADR細(xì)胞的耐藥性可能是通過抑制GSH藥物外排泵發(fā)揮作用。 綜上所述，無毒劑量的維生素D與Jurcat/ADR細(xì)胞作用后可降低細(xì)胞mdrl及mrpl mRNA的表達(dá)，同時降低P-gp及GSH的表達(dá)量，可推測維生素D具備逆轉(zhuǎn)MDR的作用，其機制可能是抑制細(xì)胞mdrl、mrpl耐藥基因的表達(dá)和降低細(xì)胞表面P～gp及細(xì)胞內(nèi)GSH含量有關(guān)，進而增加細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，提高化療藥物殺滅腫瘤細(xì)胞的作用。

[1] 張燕,張霞,魏超,等.急性白血病化療患者抑郁狀況調(diào)查分析[J].國際精神病學(xué)雜志,2015，18(3):77～79.

[2] 盧菲.急性髓性白血病耐藥相關(guān)miRNA分子功能及作用機制研究[D].山東大學(xué),2014.

[3] 白曉玲,姚慧,趙洪寧,等.急性淋巴細(xì)胞性白血病患兒WT1基因與腫瘤耐藥基因表達(dá)的關(guān)系[J].中華兒科雜志,2002,40(10):589～592.

[4] 鄧開琴.維生素D缺乏與兒童疾病研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2015,21(23):4302～4304.

① 【基金項目】湖北省科技廳基金項目，(編號：BK2008254)

1006-6233(2016)12-2050-03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.12.047