■王英超 金 紅 陳丹丹 劉美月 劉麗麗

(1.天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384）

食用菌深層發(fā)酵不僅菌絲體生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)利用率高，獲得的菌絲體具有多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，甚至在發(fā)酵液中也含有相當(dāng)豐富的初級(jí)代謝產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)、多糖）和次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-4]（如黃酮、抗菌素等），這些為開(kāi)發(fā)富含菌絲體、蛋白質(zhì)和黃酮類物質(zhì)的新型飼料提供了重要的新資源。傳統(tǒng)飼料原料如麩皮等纖維素含量高，粗蛋白含量低，缺乏黃酮等免疫活性物質(zhì)，不利于動(dòng)物消化吸收[5]。食用菌生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的一系列活性物質(zhì)既豐富了飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，又提高了飼料口感，還增強(qiáng)了動(dòng)物的抗病能力，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物吸收利用等方面均優(yōu)于普通飼料，經(jīng)濟(jì)效益明顯。本文采用桑黃菌（Phelli?nus igniarius，銹革孔菌屬多孔菌科[6]）為材料，利用深層發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中菌絲體生物量、黃酮含量和可溶性蛋白含量，通過(guò)多指標(biāo)正交試驗(yàn)篩選出桑黃菌深層發(fā)酵生產(chǎn)黃酮、可溶性蛋白和菌絲體生物量的優(yōu)化培養(yǎng)基配方，以期為我國(guó)新型飼料的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑黃菌，天津農(nóng)學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 試劑

葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、尿素、(NH4)2SO4、Mg?SO4、KH2PO4均為國(guó)產(chǎn)分析純。蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、牛血清白蛋白、槲皮素對(duì)照品購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，麥麩、玉米粉購(gòu)自天津紅旗農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 一級(jí)及二級(jí)種子液的接種及培養(yǎng)

將0.5 cm2菌塊接入固體平板，27℃暗培養(yǎng)至平板長(zhǎng)滿菌絲。取0.5 cm2兩塊菌塊接入一級(jí)種子液中，25℃培養(yǎng)箱中靜置2 d。27℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d。吸取一級(jí)種子液10 ml接入二級(jí)培養(yǎng)基中，27℃、150 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.2 碳源及氮源篩選

碳源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：蛋白胨2 g/l、KH2PO42 g/l、MgSO41 g/l，pH值自然。分別添加30 g/l的蔗糖、乳糖、麥芽糖、玉米粉和麥麩，研究不同碳源對(duì)桑黃菌絲體生物量、可溶性蛋白含量及黃酮含量的影響。氮源篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基為：葡萄糖30 g/l、KH2PO42 g/l、MgSO41 g/l，pH值自然。分別添加2 g/l的牛肉膏、酵母浸膏、麥麩、尿素和(NH4)2SO4，研究不同氮源對(duì)桑黃菌絲體生物量、可溶性蛋白含量及黃酮含量的影響。

1.3.3 菌絲體生物量的測(cè)定

將桑黃發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，去掉上清液后得到桑黃菌絲體，用蒸餾水洗滌菌絲體至無(wú)色，于恒溫干燥箱中60℃條件下烘干至恒重，電子天平稱量并記錄。

1.3.4 發(fā)酵液中黃酮含量和可溶性蛋白含量的測(cè)定

取桑黃菌株7 d的發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行黃酮和可溶性蛋白含量的測(cè)定[7-8]。以槲皮素濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，在285 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，繪出黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y=36.800x+0.007 4，R2=0.996 7。以蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，在595 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸線性方程為：y=5.851 4x+0.002 1；R2=0.997 1。

1.3.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)篩選出的碳源和氮源，結(jié)合基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 4因素4水平正交試驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 桑黃菌絲體生物量的變化

桑黃菌二級(jí)種子液接種4 d后菌絲體生物量的變化見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，菌絲體生物量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加。在第4 d培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)菌絲體，第7 d時(shí)，菌絲體生物量達(dá)到最高6.097 mg/ml。7 d后菌絲生物量開(kāi)始逐漸下降。發(fā)酵液中菌絲的形態(tài)由原來(lái)緊密扭結(jié)的球狀菌絲表面附有大量白色絮狀物，發(fā)酵液由澄清變?yōu)闇啙?，隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)增加，球狀菌絲消失，菌絲變成細(xì)而短的片段，此時(shí)發(fā)酵液為糊狀液體。因此，桑黃深層培養(yǎng)7 d可獲得最大菌絲體生物量。

圖1 桑黃菌絲體生物量的變化

2.2 桑黃發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量變化曲線(見(jiàn)圖2)

圖2 桑黃發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量變化曲線

由圖2可知，培養(yǎng)時(shí)間在4～7 d，黃酮的產(chǎn)量不斷增加，7 d時(shí)達(dá)到最大值0.200 mg/ml。7～10 d，黃酮含量明顯下降。此時(shí)發(fā)酵液顏色呈現(xiàn)亮黃色。因此選擇發(fā)酵7 d作為桑黃產(chǎn)黃酮的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

2.3 桑黃發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白含量變化曲線

結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，桑黃發(fā)酵液中可溶性蛋白的含量變化不大，范圍在0.31～0.41 mg/ml，培養(yǎng)7 d時(shí)達(dá)到最大值0.41 mg/ml。因此選擇發(fā)酵7 d作為桑黃產(chǎn)可溶性蛋白的最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖3 桑黃發(fā)酵過(guò)程中可溶性蛋白含量變化

2.4 碳源的篩選

采用不同的碳源對(duì)桑黃進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，桑黃在添加蔗糖的條件下，菌絲體生物量為4.452 mg/ml添加麥芽糖，菌絲體生物量為4.195 mg/ml。在以麥麩和玉米粉為碳源的情況下，桑黃菌絲體生物量?jī)H為蔗糖和麥芽糖的一半。乳糖作為碳源，菌絲體生物量低于蔗糖和麥芽糖。

不同碳源在桑黃深層培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)可溶性蛋白及黃酮含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。在有麥麩的條件下，黃酮的含量最大為0.270 mg/ml。而有麥芽糖、乳糖、蔗糖的條件下，黃酮含量差異不大。具體表現(xiàn)為0.199、0.228、0.224 mg/ml。以黃酮為主要參考指標(biāo)時(shí)，麥麩為最佳碳源。不同的碳源下可溶性蛋白含量存在明顯差異性。具體表現(xiàn)為：麥麩＞玉米粉＞乳糖＞麥芽糖＞蔗糖。以可溶性蛋白含量為參考指標(biāo)時(shí)，麥麩也為最佳碳源。綜合菌絲體生物量、黃酮含量、可溶性蛋白含量3個(gè)指標(biāo)，本試驗(yàn)篩選出麥麩作為最佳碳源。

圖4 不同碳源對(duì)桑黃深層發(fā)酵物中菌絲體生物量的影響

圖6 不同碳源對(duì)桑黃深層發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響

2.5 氮源的篩選

采用不同的氮源對(duì)桑黃液體深層培養(yǎng)進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，不同氮源下黃酮含量大小為：酵母浸膏＞牛肉膏＞尿素＞硫酸銨＞麥麩。以黃酮為參考指標(biāo)，篩選出酵母浸膏作為培養(yǎng)用氮源。不同的氮源對(duì)桑黃蛋白質(zhì)的產(chǎn)量也有較大的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可以看出，可溶性蛋白的含量大小依次為：酵母浸膏＞牛肉膏＞硫酸銨＞麥麩＞尿素。桑黃能夠很好地利用有機(jī)氮源來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的生物合成（除了麥麩以外），而無(wú)機(jī)氮源也能使桑黃進(jìn)行蛋白質(zhì)的生物合成生產(chǎn)蛋白質(zhì)，但是利用效果不比有機(jī)氮源。不同氮源對(duì)桑黃菌絲體生物量的影響結(jié)果見(jiàn)圖9。桑黃菌絲體生物量大小依次為：尿素＞牛肉膏＞硫酸銨＞酵母浸膏＞麥麩。綜合黃酮、可溶性蛋白、菌絲體生物量3個(gè)指標(biāo)考慮，選擇酵母浸膏作為最佳氮源。

圖7 不同氮源對(duì)桑黃深層發(fā)酵物中黃酮含量的影響

圖8 不同氮源對(duì)桑黃深層發(fā)酵物中菌絲體生物量的影響

圖9 不同氮源對(duì)桑黃深層發(fā)酵物中可溶性蛋白含量的影響

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的前提下，進(jìn)行4因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以桑黃發(fā)酵液中菌絲體生物量、黃酮含量和可溶性蛋白含量為主要考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可知，以桑黃菌絲體生物量為考察指標(biāo)的培養(yǎng)基最優(yōu)方案為A2B4C3D2，以黃酮含量考察指標(biāo)的培養(yǎng)基最優(yōu)方案為A4B3C3D2，以可溶性蛋白含量為考察指標(biāo)的培養(yǎng)基最優(yōu)方案為A3B4C2D3。這3個(gè)方案不完全相同，因此采用綜合平衡法[7]進(jìn)行多指標(biāo)影響分析，獲得能兼顧菌絲體生物量、黃酮和可溶性蛋白3個(gè)指標(biāo)均衡的培養(yǎng)基優(yōu)化方案。

從表2看出，因素A(麥麩)對(duì)各指標(biāo)的影響：黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體生物量的極差均較大，說(shuō)明麥麩是影響最大的因素。對(duì)黃酮來(lái)講，A4水平最好，對(duì)菌絲體生物量和可溶性蛋白含量來(lái)講，A4水平也不是太差。綜合來(lái)說(shuō)，針對(duì)3個(gè)指標(biāo)，麥麩取A4水平；因素B（酵母浸膏）對(duì)各指標(biāo)的影響：3個(gè)指標(biāo)的極差均較大，說(shuō)明酵母浸膏是僅次于麥麩的影響因素。對(duì)黃酮來(lái)講，B3水平最好，B4水平也不是太差。對(duì)可溶性蛋白和菌絲體生物量來(lái)講，B4水平最好。針對(duì)3個(gè)指標(biāo)，酵母浸膏取B4水平；因素C（KH2PO4）對(duì)各指標(biāo)的影響：黃酮含量和可溶性蛋白含量的極差都不是最大，也就是說(shuō)KH2PO4影響不大，對(duì)菌絲體生物量和黃酮含量來(lái)講，均以C3水平最好；對(duì)可溶性蛋白含量，C2水平最好，C3也不是太差。針對(duì)3個(gè)指標(biāo)，KH2PO4取C3水平最好；因素D（MgSO4）對(duì)各指標(biāo)的影響：黃酮含量、菌絲體生物量、可溶性蛋白含量的極差均較小，說(shuō)明MgSO4是影響最小的因素。以菌絲體生物量和黃酮含量來(lái)講，D2水平最好。以可溶性蛋白含量來(lái)講，取D3水平最好，D2水平也不是太差。針對(duì)3個(gè)指標(biāo)，MgSO4取D2水平最好。綜上分析，經(jīng)過(guò)綜合平衡得到培養(yǎng)基最優(yōu)方案為A4B4C3D2。在最優(yōu)方案下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，黃酮含量為1.173 mg/ml，可溶性蛋白含量為1.425 mg/ml，菌絲體生物量為7.448 mg/ml。

3 討論

綜合平衡法是指在正交試驗(yàn)結(jié)果分析中先分別考察每個(gè)因素對(duì)各指標(biāo)的影響，然后進(jìn)行分析比較，確定出最好的水平，從而得到最好的試驗(yàn)方案[8]。其原理同加權(quán)法一樣，都是綜合方差分析、因素貢獻(xiàn)率和同一因素下不同水平效應(yīng)差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定試驗(yàn)最優(yōu)組合。但不同的是，綜合平衡法分別考察了每個(gè)因素對(duì)各指標(biāo)的影響，更能發(fā)現(xiàn)每個(gè)因素與指標(biāo)之間的關(guān)系[7]。本文采用綜合平衡法，得到富含黃酮、可溶性蛋白和菌絲體生物量的最優(yōu)培養(yǎng)基配方，相比其他以單一指標(biāo)為篩選條件來(lái)講更客觀合理。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

4 結(jié)論

以菌絲體生物量、黃酮和可溶性蛋白的含量為綜合考察指標(biāo)，采用多指標(biāo)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出黃酮含量、可溶性蛋白含量和菌絲體生物量均較高的培養(yǎng)基配方。最優(yōu)培養(yǎng)基配方為麥麩6%、酵母浸膏0.5%、KH2PO40.2%、MgSO40.1%。在最優(yōu)培養(yǎng)基配方下進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，得到黃酮含量為1.173 mg/ml，可溶性蛋白含量為1.425 mg/ml，菌絲體生物量為7.448 mg/ml。配方經(jīng)過(guò)優(yōu)化后生產(chǎn)出的發(fā)酵液富含黃酮和可溶性蛋白，營(yíng)養(yǎng)豐富，可以作為動(dòng)物特色營(yíng)養(yǎng)飼料成分使用。