謝志勤，謝芝勛，范 晴，鄧顯文，謝麗基，羅思思，黃 莉，黃嬌玲，張艷芳，王 盛，張民秀，奉 彬，劉加波，龐耀珊

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室，廣西南寧 530001)

H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR檢測方法的建立

謝志勤，謝芝勛*，范 晴，鄧顯文，謝麗基，羅思思，黃 莉，黃嬌玲，張艷芳，王 盛，張民秀，奉 彬，劉加波，龐耀珊

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西動物疫病病原生物學與診斷重點實驗室，廣西南寧 530001)

根據(jù)GenBank中H9亞型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列，通過Blast進行比對，在各自保守的基因序列中分別設計了兩對特異性擴增引物，引物擴增的片段大小分別為569 bp和424 bp，應用這兩對引物建立了H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR檢測方法，對建立的方法進行了特異性試驗、敏感性試驗和臨床樣品驗證。對檢測為陽性的樣品進行克隆和序列分析，以驗證本方法的準確性。特異性試驗結(jié)果表明，所有參試的H9亞型禽流感病毒都能擴增出大小為569 bp的片段，參試的禽肺病毒毒株擴增出424 bp的片段，沒有其他條帶出現(xiàn)，而對照的參試毒株在569 bp和424 bp處沒有任何條帶；敏感性試驗結(jié)果表明，本試驗建立的方法能檢測到10 pg的H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。應用本試驗建立的方法對廣西采集的病雞樣品132份進行檢測，H9亞型禽流感病毒陽性的樣品有6份，禽肺病毒陽性的樣品2份；隨機各挑取2份H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒陽性PCR產(chǎn)物進行克隆和序列分析，經(jīng)比對分析，2份H9亞型禽流感病毒陽性PCR產(chǎn)物與H9亞型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源，2份禽肺病毒陽性PCR產(chǎn)物與禽肺病毒株(No.AF187154) 100%同源。本試驗建立的H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR檢測方法具有特異、敏感、快速的特點，可以用于臨床快速準確檢測H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒。

H9亞型禽流感病毒；禽肺病毒；二重反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應；檢測

H9亞型禽流感病毒(Avian influenza virus H9 subtype，AIV H9)和禽肺病毒(Avian pneumovirus，APV)是危害養(yǎng)雞業(yè)的兩種重要病毒，H9亞型禽流感病毒屬正黏病毒科A型流感病毒屬,病毒基因組為分節(jié)段的單股負鏈RNA ,包含HA、NA、M、PB1、PB2、NP、PA、NS 8個基因組[1]。禽肺病毒屬于肺病毒亞科中的成員[2]，全基因組長約14 kb，為負鏈RNA?；蛑杏?種編碼蛋白，依次為核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、第二基質(zhì)蛋白(M2)、小疏水蛋白(SH)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白L[3-4]。在8種蛋白中，F(xiàn)蛋白是很重要的結(jié)構(gòu)蛋白，參與吸附細胞的作用[5]。目前將禽肺病毒劃分為4個亞型，分別命名為A、B、C、D亞型，A亞型和B亞型在世界各國都有發(fā)生，C亞型只在美國發(fā)生，D亞型則在法國出現(xiàn)[4,6-7]。

在臨床上這兩種病毒引起的癥狀很相似，都可以引起禽上呼吸道的癥狀。禽肺病毒除了引起禽出現(xiàn)噴嚏、眼結(jié)膜潮紅和淚腺腫脹外，其明顯的特征是后期出現(xiàn)頭部皮下腫大，有些伴隨有神經(jīng)癥狀[8]。感染產(chǎn)蛋雞可以引起產(chǎn)蛋下降 2%～40%。感染種雞后種蛋的孵化率和出殼率都降低[9]。H9亞型禽流感病毒感染雞同樣也會引起上呼吸道的癥狀，主要以咳嗽、呼吸啰音和支氣管堵塞為特征。蛋雞感染可以引起產(chǎn)蛋下降，在感染期間繼發(fā)其他疫病時可引起雞大批死亡[10]。在臨診上很難將它們區(qū)別，需通過實驗室進行確診。目前實驗室診斷這兩種傳染病的方法主要有病毒分離[11-12]、RT-PCR[13,16]、ELISA[17-18]、LAMP[19]和免疫電化學檢測方法[20]等。

H9亞型禽流感病毒HA蛋白和禽肺病毒融合蛋白(F)是很重要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白，在各自病毒中各具特征性，常常用于檢測并鑒別這兩種病毒。目前，還未見應用二重RT-PCR方法一次擴增同時將這兩種病毒區(qū)別的報道。本研究通過在各自基因保守區(qū)域設計兩對不同的引物，建立二重RT-PCR一次擴增鑒別H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒的方法，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用毒株 H9亞型禽流感病毒株：H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)、H9N2(A/Duck/Guangxi/RX/2009)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)由本室保存；禽肺病毒(APV/MN-10)由美國濱夕法尼亞大學Lu教授惠贈；對照毒株雞傳染性支氣管炎病毒(Mass 41)、雞傳染性喉氣管炎病毒(北京株，ILTV )、禽腦脊髓炎病毒(AEV Van)、雞毒支原體(MG S6)均由本實驗室保存；雞新城疫病毒 (NDV La Sota株)、禽呼腸病毒(Reo S1133)和禽大腸埃希菌(E.coliO2)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；雞馬立克病(MDV)疫苗毒購自南京梅里亞動物保健品公司。

1.1.2 試驗用SPF雞胚 從北京梅里亞種禽有限公司購進SPF種蛋，經(jīng)本室自動化孵化箱37℃孵化至7到10日齡。

1.1.3 儀器和試劑 T100 PCR擴增儀為美國Bio-rad產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA抑制劑、dNTPs、自由引物、2×PremixTaqTM mix 等購自大連寶生生物工程有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收純化試劑盒購自美國OMEGA公司；其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)基因庫中已發(fā)表的H9亞型禽流感病毒HA基因序列(基因庫序列號：JF715045.1)和禽肺病毒F基因序列(基因庫序列號：AF187154)，通過DNAStar MegAlign軟件對下載的序列進行比對分析，找出H9亞型禽流感病毒HA基因序列和禽肺病毒F基因序列各自保守的基因序列區(qū)間。應用PrimerSelect 軟件在其保守的基因序列區(qū)間設計了兩對特異性引物，并在線Blast比對分析，經(jīng)分析符合要求的引物序列發(fā)給大連寶生生物有限公司進行合成(表1)。

表1 用于H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒擴增的引物序列

Table 1 Primer sequences used for AIV H9 and APV

引物Primers序列Sequence(G+C)/%大小/bpSize位置SiteAIVH9F5'-ACGCCCAATACACAAATAATCAAG-3'37.5569518-541AIVH9R5'-GAATCCATACCAACCAGCAACTA-3'43.41086-1064APVF5'-ATCGGGCAATGGTCAGAAGG-3'55424753-772APVR5'-ACACCGTCATAACAGGCTACCAA-3'47.81176-1154

1.2.2 病毒的增殖及處理

1.2.2.1 H9亞型禽流感病毒的增殖及處理 將H9亞型禽流感病毒株用滅菌的PBS溶液按1∶100倍進行稀釋，經(jīng)雞胚尿囊腔分別接種10日齡的SPF雞胚，每胚0.2 mL，收集24 h～120 h死亡雞胚和活胚尿囊液，雞胚尿囊液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，上清液用來提取RNA或保存在-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 禽肺病毒的增殖及處理 按謝志勤報道的方法[21]進行增殖和處理。

1.2.3 臨床樣品收集及處理 取病雞的肺、氣管、脾、腎等組織適量，按1∶5加入滅菌的PBS溶液進行研磨，研磨后的懸液分裝于1.5 mL離心管，放在-70℃冰柜反復凍融3次，8 000 r/min離心5 min，上清液用作病毒增殖或提取病毒RNA。

1.2.4 RNA的提取 按謝志勤報道的方法[22]進行總RNA提取，提取的總RNA置-20℃保存或直接用于反轉(zhuǎn)錄。

1.2.5 RT-PCR擴增條件的優(yōu)化 優(yōu)化RT-PCR 擴增反應體系所用的 buffer、dNTPs、Mg2+、9堿基自由引物、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、RNA 抑制劑、RNA模板濃度、Taq酶以及擴增反應的退火溫度、程序等，優(yōu)化出最佳各種反應濃度和條件。

1.2.6 擴增產(chǎn)物的檢測 用1倍的TBS溶液制備濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠，取2 μL加樣緩沖液與10 μL擴增產(chǎn)物混合，點入瓊脂糖凝膠孔中，同時點入標準分子質(zhì)量作為對照，以80 V/cm電泳，至樣品超過凝膠中線，停止電泳，取下凝膠經(jīng)Gelred(Biotium產(chǎn)品，1萬倍稀釋)染色后，在紫外線臺上觀察并拍照，分析記錄結(jié)果。

1.2.7 特異性及敏感性試驗 以AIV H9N2(066C)和APV/MN-10以及對照的NDV La Sota、IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2的RNA或DNA作為模板，進行RT和PCR擴增，以檢測其特異性。測定AIV H9N2(066C)和APV/MN-10的RNA濃度，然后進行10倍梯度稀釋，取各稀釋度的RNA 1 μL作為模板進行敏感性測定

1.2.8 臨床樣品的檢測 提取保存的經(jīng)1.2.3處理的132份廣西不同地區(qū)養(yǎng)雞場收集的病雞的肺、氣管、脾及腎樣品的RNA，應用建立的二重RT-PCR檢測方法對提取的樣品RNA進行檢測。同時取經(jīng)1.2.3處理的相同樣品，經(jīng)0.2 μm濾膜無菌過濾，進行病毒分離。卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚。以評價本方法對臨床樣品檢測的實用性。

1.2.9 序列分析比對驗證 隨機挑選H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒各2份PCR檢測陽性樣品進行序列測定比對驗證，將回收純化的PCR檢測陽性產(chǎn)物與PMD18-T進行連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中。提取轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，用雙酶切和PCR進行鑒定。經(jīng)鑒定為陽性的克隆菌，送寶生物工程(大連)有限公司測定序列。應用DNA Star軟件對測定的序列與H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒株進行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增產(chǎn)物檢測

將12μL RT-PCR產(chǎn)物(含2 μL加樣緩沖液)加入預先用1倍TBE溶液制備的15 g/mL瓊脂糖凝膠孔中，以80 V/cm電壓進行凝膠電泳，后經(jīng)goldenview染色，放紫外線下進行觀察拍照，可見H9亞型禽流感病毒株樣品擴增出大小約為569 bp的明亮條帶，APV毒株樣品擴增出約為424 bp的明亮條帶，與預期大小相符。

2.2 RT-PCR擴增條件優(yōu)化的確定

經(jīng)對RT-PCR擴增各成分配比和反應條件的優(yōu)

化篩選，獲得最佳的配比和反應條件為：反轉(zhuǎn)錄(RT)采用10 μL 反應體系：5×RT buffer(含10 μmol/L dNTPs、Mg2+) 2 μL，50 μmol/L Random 9 mer(自由引物) 0.5 μL,反轉(zhuǎn)錄酶(AMV) 0.5 μL，RNA 抑制劑 0.5 μL，AIV H9N2(066C10)和APV/MN-10模板RNA各 2 μL，用滅菌的無RNA水補足10 μL。置PCR儀設定反應程序：42 ℃ 60 min，95℃ 5 min。反應結(jié)束后進行 PCR 擴增，采用25 μL反應體系：2×PremixTaqTM mix 12.5 μL[寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號：RR003A，內(nèi)含10 μmol/L dNTPs、Mg2+、5 unit ExTaq酶]，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL，50 pmol/μL 的APV上、下游引物各 0.25 μL，50 pmol/μL 的AIV H9上、下游引物各 0.25 μL，滅菌超純水補足 25 μL，置PCR儀設定反應程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃結(jié)束反應。

2.3 特異性及敏感性試驗

參試的H9亞型禽流感病毒株H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)、H9N2(A/Duck/Guangxi/RX/2009)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)均擴增出大小約為569 bp的特異性條帶，APV擴增出約424 bp的特異性條帶，而對照的NDV La Sota、IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2在247 bp與424 bp處均無條帶出現(xiàn)(圖1)。以10倍梯度稀釋的AIV H9N2(066C10)和APV/MN-10的核酸作為模板進行敏感性試驗，結(jié)果最低能檢測到10 pgRNA模板(圖2)。

M.DNA 標準DL 1 000；1.APV RNA；2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA；3.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA和APV RNA的混合模板(模板摩爾比1∶1)；4.AIV H9N2(A/Duck/Guangxi/RX/2009)RNA和APV RNA的混合模板；5.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)RNA和APV RNA的混合模板；6.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)RNA和APV RNA的混合模板；7.NDV(La Sota)RNA ；8.IBV Mass 41；9. AE Van；10. Reo S1133；11.ILTV(北京株)；12.MDV(疫苗株)；13.MG S6；14.大腸埃希菌O2

M.DNA Marker DL 1 000; 1.APV RNA; 2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA; 3.AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/LF/2007) RNA and APV RNA mixed template (template molar ratio 1∶1); 4.AIV H9N2 (A/Duck/Guangxi/RX/2009) RNA and APV mixed template of RNA; 5.AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/067C4/2010) RNA and APV mixed template of RNA; 6.AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/066C10/2010) RNA and APV mixed template of RNA; 7.NDV (La Sota) RNA; 8.IBV Mass 41; 9.AE Van; 10. Reo S1133; 11.ILTV (Beijing strain); 12.MDV (vaccine strain); 13.MG S6; 14.E.coliO2

圖1 二重RT-PCR特異性試驗結(jié)果

Fig.1 Specificity test results of duplex PCR

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

對132份病雞樣品核酸進行檢測，檢測結(jié)果有6份樣品為雞H9亞型禽流感病毒陽性，2份樣品為禽肺病毒陽性，其余的124份樣品均不是H9亞型禽流感病毒或禽肺病毒陽性。經(jīng)樣品病毒分離鑒定，臨床樣品檢測與病毒分離鑒定結(jié)果一致(圖3)。

2.5 序列分析驗證

對隨機抽取的2份雞H9亞型禽流感病毒和2份禽肺病毒陽性PCR擴增產(chǎn)物進行序列測定，利用DNAstar軟件進行分析，經(jīng)比對2份雞H9亞型禽流感病毒陽性PCR產(chǎn)物與H9亞型禽流感病毒株(No.JF715045.1)100%同源，2份禽肺病毒陽性PCR產(chǎn)物與禽肺病毒株(No.AF187154) 100%同源。

M.DNA 標準DL 1 000；1.100 ng AIV H9和100 ng APV RNA；2.10 ng AIV H9和10 ng APV RNA；3.1 ng AIV H9和1 ng APV RNA；4.100 pg AIV H9和1 000 pg APV RNA；5.10 pg AIV H9和10 pg APV RNA；6.1 pg AIV H9和1 pg APV RNA；7.100 fg AIV H9和100 fg APV RNA

M.DNA Marker DL 1000；1.100 ng AIV H9 and 100 ng APV RNA；2.10 ng AIV H9 and 10 ng APV RNA；3.1 ng AIV H9 and 1 ng APV RNA；4.100 pg AIV H9 and 100 pg APV RNA；5.10 pg AIV H9 and 10 pg APV RNA；6.1 pg AIV H9 and 1 pg APV RNA；7.100 fg AIV H9 and 100 fg APV RNA

圖2 二重RT-PCR的敏感性試驗結(jié)果

Fig.2 Sensitivity test results of duplex PCR

M.DNA 標準DL 1 000 ；1.APV RNA；2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA；3.APV RNA和AIVH9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA的混合模板(模板摩爾比1∶1)；4.陰性對照(正常雞肺、氣管組織RNA)；5.臨床樣品C20120427 RNA；6.臨床樣品C20120314 RNA；7.臨床樣品C20130201 RNA；8.臨床樣品C20130417 RNA；9.臨床樣品C20130618 RNA；10.臨床樣品C20130707 RNA；11.臨床樣品C20130821 RNA；12.臨床樣品C20130911 RNA；13.臨床樣品C20130928 RNA；14.臨床樣品C20131012 RNA；15.臨床樣品C20131016 RNA；16.臨床樣品C20131018 RNA

M.DNA Marker DL 1000; 1.APV RNA; 2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA;3.RNA APV and AIVH9N2 (A/Chicken/Guangxi/LF/2007) RNA mixed template (template molar ratio 1∶1) ;4.Negative control (normal chicken lung, trachea tissue RNA) ;5.Clinical sample RNA C20120427;6.Clinical sample RNA C20120314;7.Clinical sample RNA C20130201;8.Clinical sample RNA C20130417;9.Clinical sample RNA C20130618;10.Clinical sample RNA C20130707 RNA;11.Clinical sample RNA C20130821 RNA;12.Clinical sample RNA C20130911 RNA;13.Clinical sample RNA C20130928 RNA;14.Clinical sample RNA C20131012 RNA;15.Clinical sample RNA C20131016 RNA;16.Clinical sample RNA C20131018 RNA

圖3 二重RT-PCR對臨床樣品檢測結(jié)果

Fig.3 Clinical sample test results of duplex PCR

3 討論

防控雞主要疫病的發(fā)生一直是現(xiàn)代養(yǎng)雞業(yè)的首要任務，對雞危害嚴重的幾種疫病中，禽流感仍然是防控的主要傳染病，雖然我國一直對禽流感病毒引起的疾病采取各種預防措施，但是每年卻因該病引起的損失仍然十分巨大。相比禽流感等重大疫病而言，禽肺病毒引起雞的疾病還沒有引起人們足夠重視和注意。禽肺病毒最早報道是引起火雞的呼吸道疾病，隨后在歐洲流行，病死率可高達25%～40%[23]。我國最早報道該病是1998年[24]， 2009年郭龍宗等[25]進行的血清學調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國雞群中禽肺病毒感染很普遍，感染率高的可達100%，其引起的損失難以估計。

禽肺病毒和H9亞型禽流感病毒引起雞的癥狀臨床上很相似，主要表現(xiàn)為上呼吸道的癥狀，尤以噴嚏、眼結(jié)膜潮紅、淚腺腫、產(chǎn)蛋下降、孵化率低以及神經(jīng)癥狀為主。單靠臨床癥狀很難將它們區(qū)別開來，需要進一步通過實驗室進行確診。雖然檢測鑒別H9亞型禽流感病毒的方法有很多，但是臨床上還沒有同時檢測鑒別禽肺病毒和H9亞型禽流感病毒的方法，因此建立一種同時檢測鑒別這兩種病毒方法具有重要的現(xiàn)實意義。

禽肺病毒的融合蛋白(F)和禽流感病毒的血凝蛋白(HA)已被證實是很重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其蛋白序列結(jié)構(gòu)不一樣，但都具有種屬特征性，因此這兩個蛋白往往被用于檢測區(qū)分各自的病毒特征。本研究利用禽肺病毒的融合蛋白(F)和禽流感病毒的血凝蛋白(HA)種屬特征性，在其基因保守序列區(qū)域設計了分別擴增禽肺病毒和H9亞型禽流感病毒的兩對特異性引物，建立了二重RT-PCR方法一次擴增鑒別禽肺病毒和H9亞型禽流感病毒的方法。特異性試驗結(jié)果證實，所有參試的H9亞型禽流感病毒毒株均能擴增出大小約為569 bp的特異性條帶，APV擴增出約424 bp的特異性條帶，而對照的參試毒株NDV La Sota、IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2在569 bp和424 bp處均無條帶出現(xiàn)，說明本試驗建立的H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒檢測方法具有特異性。本試驗建立的方法最低能檢測10 pg的禽肺病毒和H9亞型禽流感病毒的RNA模板，表明本試驗建立的方法具有很好的敏感性。

為了進一步驗證本試驗建立的方法，將建立的方法對臨床樣品進行檢測，結(jié)果雞H9亞型禽流感病毒陽性6份，陽性檢測率為4.55%(6/132)，禽肺病毒陽性2份，陽性檢測率為1.51%(2/132)，檢測的結(jié)果與分離鑒定結(jié)果一致。同時對2份H9亞型禽流感病毒陽性樣品和2份禽肺病毒陽性樣品進行序列測定比較，證實所擴增的各自基因序列片段正確，說明本試驗建立的方法具有很好的實用性，可以用于臨床檢測，為快速鑒別檢測H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒提供了一種更快捷的方法。

綜上所述，本研究建立了二重RT-PCR檢測并鑒別H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒的方法，通過對建立方法的特異性、敏感性和臨床樣品檢測，證實所建立的方法特異、敏感。臨床樣品檢測結(jié)果經(jīng)與分離鑒定和序列測定比較，結(jié)果均正確。該方法的建立為快速檢測并鑒別H9亞型禽流感病毒和禽肺病毒提供了技術(shù)保障。

[1] Miodek A,Sauriat-Dorizon H,Chevalier C,et al.Dierct electrochemical detection of PB1-F2 protein of influenza A virus in infected cells[J].Biosesors Bioelectronics,2014,59:6-13.

[2] Pringle C R.Virus taxomy[J].Arch Virol,1998,143:1449-1459.

[3] Naylor C J,Brown P A,Edworthy N,et al.Development of a reverse-genetics system for avian pneumovirus demonstrates that the small hydrophobic(SH) and attachment(G) genes are not essential for virus viability[J].J Gen Virol,2004,85:3219-3227.

[4] 胡海霞，趙 偉，于慶忠.禽偏肺病毒分子生物學及基因工程疫苗研究進展[J]，中國家禽，2012,34(12)：1-5.

[5] Cook J K,Cavanagh D.Detection and differentiation of avian pneumovirus(metpneumovirus)[J].Avian Pathol,2002,31:117-132.

[6] Buys S B,du Preez J H.A preliminary report on the isolation of a virus causing sinusitis in turkeys in south Africa and attempts to attenuate the virus [J].Turkeys,1980,28:36-56.

[7] Bayon Auboyer M H,Arnauld C,Toquin D,et al.Nucleotide sequences of the F,L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup[J].J Gen Virol,2000,81:2723-2733.

[8] Jones R C,Williams R A,Baxter-Jones C,et al.Experimental infection of laying turkeys with rhinotracheitis virus:distribution of virus in the tissues and serological response[J].Avian Pathol,1998,17:841-850.

[9] 王 艷，莊金秋，梅建國，等.禽偏肺病毒檢測方法研究進展[J]，動物醫(yī)學進展，2015，36(6)：130-134.

[10] Chen F,Yan Z Q,Liu J,et al.Phylogenetic analysis of hemagglutinin genes of H9N2 subtype avian influenza A viruses isolated from poultry in China from 2010 to 2011[J].Virus Genes,2012,45:69-75.

[11] Xu Q,Xie Z X,Xie L J,et al.Characterization of an avian influenza virus H9N2 strain isolated from a wildbird in southern China[J].Genome Announce,2014,2(3):e00600-e00614.

[12] Goyal S M,Chiang S J,Dar A M,et al.Isolation of avian pneumovirus from an outbreak of respiratory illness in Minnesota turkeys[J].Vet Diagn Invest,2000,12:166-168.

[13] 徐 倩，謝芝勛，謝麗基,等.禽流感病毒H9N2亞型三重PCR檢測方法的建立[J]，中國畜牧獸醫(yī)，2014,41(11):58-62.

[14] 陳 琳，刁有祥，鄒金峰.禽偏肺病毒RT-PCR檢測方法的建立及應用[J],中國獸醫(yī)學報，2012,32(7)：971-974,996.

[15] Shin H J,Rajashekara G,Jirjis F F,et al.Specific detection of avian pneumovirus (APV) U.S.isolates by RT-PCR[J].Arch Virol,2000,145:1239-1246.

[16] 徐 倩，謝芝勛，謝麗基,等.禽流感病毒H9和N2亞型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J]，動物醫(yī)學進展，2015,36(1)：11-15.

[17] Gulati B R,Cameron K T,Seal B S,et al.Development of a highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant matrix protein for detection of avian pneumovirus antibodies[J].J Clin Microbiol,2000,38(13):4010-4014.

[18] Goyal S M,Lauer D,Friendshuh K,et al.Seroprevalence of avian pneumovirus in Minnesota turkeys[J].Avian Dis,2003,47(3):700-706.

[19] 謝志勤，謝芝勛,劉加波，等.禽肺病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J],中國動物檢疫，2013,30(3)：48-51.

[20] 亓文寶，李 芳，李華楠，等.H9 亞型AIV 型特異性電化學發(fā)光免疫檢測方法的建立[J]，中國農(nóng)業(yè)科學，2015,48(15):3064-3070.

[21] 謝志勤，謝芝勛,劉加波，等.禽肺病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J],動物醫(yī)學進展，2014,35(10)：1-6.

[22] Xie Z Q，Khan M I,Girshick T,et al.Reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect avian encephalomyelitis virus[J].Avian Dis，2005,49(2)：227-230.

[23] Cook J K，Chesher J，Orthel F，et al.Avian pneumovirus infection of laying hens：experimental studies[J].Avian Pathol,2000,29(6):45-556.

[24] 沈瑞忠，曲立新，于康震，等.禽肺病毒的分離鑒定[J],中國預防獸醫(yī)學報，1999，21(1)：76-77.

[25] 郭龍宗，曲立新.種雞禽肺病毒感染的血清學調(diào)查[J],中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(4)：149-150.

Development of a Duplex RT-PCR for Detecting Avian Influenza H9 Subtype and Avian Pneumovirus

XIE Zhi-qin,XIE Zhi-xun,FAN Qing,DENG Xian-wen,XIE Li-ji,LUO Si-si,HUANG Li,HUANG Jiao-ling,ZHANG Yan-fang,WANG Sheng,ZHANG Min-xiu,FENG Bin,LIU Jia-bo,PANG Yao-shan

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnosis,Nanning,Guangxi,530001,China)

A rapid and specific method for detection of avian influenza virus H9 subtype (AIV H9) and avian pneumovirus(APV) by duplex RT-PCR was developed.Two pairs of primers were designed and synthesized base on HA gene of AIV H9 and the F gene of APV after comparisons by Blast.Duplex RT-PCR was set to detect AIV H9 and APV with two pair of primers,569 bp in length of AIV H9,424 bp in length of APV were amplified.Specificity test results showed that all test strains from AI H9,and APV were positive.Other pathogen strains as contrasts were negative.This duplex RT-PCR was able to detect at least 10 pg template each of AI H9 and APV.132 clinical samples collected from different chicken farms were detected by this RT-PCR. 6 of 132 samples were positive for AI H9,2 of 132 samples were positive for APV. 2 AIV H9 positive samples and 2 APV positive samples were used for PCR amplification and sequencing.Homology analysis showed 100% homology with AIV H9 (No.JF715045.1)and APV(No.AF187154).A rapid and specific method was set to detect AIV H9 and APV.

Avian influenza virus H9 subtype; Avian pneumovirus; duplex RT-PCR; detection

2016-05-16

廣西科技廳專項(桂科AD16380009,桂科合14123001-8，桂科重14121003-4-2，桂科專項16-1)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFDA019015)；國家萬人計劃領(lǐng)軍人才專項(2016-37)

謝志勤(1965-)，男，廣西蒼梧人，研究員，碩士，主要從事獸醫(yī)分子生物學研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)12-0007-06