李春祿,馬文才,喬明明,楊欣艷,張彥明*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊陵 712100；2.北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094)

某規(guī)?；i場偽狂犬病的診斷

李春祿1,2,馬文才1,喬明明2,楊欣艷2,張彥明1*

(1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊陵 712100；2.北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094)

河南平頂山某豬場母豬出現(xiàn)較嚴重的流產(chǎn)和產(chǎn)死胎現(xiàn)象，且50日齡～70日齡仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，根據(jù)臨床表現(xiàn)初步診斷為偽狂犬病。為排除豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟，進行了實驗室診斷。應(yīng)用ELISA方法檢測發(fā)病保育豬及母豬血清的偽狂犬病病毒野毒株gE抗體，并對發(fā)病仔豬病料進行了偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)的實時熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示，偽狂犬病病毒野毒抗體陽性，實時熒光定量PCR檢測確定仔豬病料中PRV核酸陽性，PRRSV和CSFV核酸陰性。結(jié)合臨床癥狀及實驗室檢測，確診該豬場發(fā)生的是豬偽狂犬病。

豬偽狂犬病；酶聯(lián)免疫吸附試驗；實時熒光定量PCR；診斷

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病病毒的主要宿主和儲存者，除豬以外的其他動物發(fā)病后通常具有發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等癥狀，均為致死感染。仔豬和其他易感動物一旦感染該病，病死率較高[1]。PRV主要引起母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，公豬不育，新生仔豬神經(jīng)癥狀和腹瀉[2]，與豬瘟(CSF)和豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)癥狀相似，極易誤診。因此，必須借助于實驗室方法，才能夠?qū)υ摬∵M行確診。

河南平頂山某規(guī)?；i場，基礎(chǔ)母豬存欄1 500頭，種豬群每年進行4次豬偽狂犬病疫苗預防接種，初生仔豬進行滴鼻免疫，肉豬55日齡進行肌肉注射免疫1次；種豬群每年進行3次豬瘟疫苗免疫接種，斷奶仔豬25日齡肌肉注射首免，60日齡加強免疫1次；豬場未進行PRRS疫苗免疫接種。2014年12月下旬，該豬場母豬突然出現(xiàn)較嚴重的流產(chǎn)和死胎現(xiàn)象，且50日齡～70日齡仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，本文將診斷結(jié)果及報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集多頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織，6頭50日齡～70日齡發(fā)病的保育豬和24頭經(jīng)產(chǎn)母豬的血清。

1.1.2 試劑 偽狂犬病病毒gE抗體檢測試劑盒為法國LSI公司生產(chǎn)；偽狂犬病病毒gE基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒、豬瘟病毒野毒株實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒等，均由北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 PRV gE抗體檢測結(jié)果的計算方法及判定標準 陰性對照OD值與陽性對照OD值的差大于0.6，陽性對照阻斷值大于60%，則試驗成立，否則試驗無效，重測。 用INH%來說明檢測結(jié)果，以下是計算方式。

INH%=[(陰性對照平均OD值-血清樣品的OD值)/(陰性對照平均OD值)]×100

判斷標準：INH%值大于45時，判斷樣品為PRV-gE抗體陽性；INH%值大于或等于40且小于或等于45時，判斷樣品可疑，必須重測；INH%值小于40時，判斷樣品為PRV-gE抗體陰性。

1.2.2 PRV gE基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測結(jié)果判定標準 陽性對照Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，試驗結(jié)果成立，否則試驗結(jié)果無效，重測。

判斷標準：被檢樣品Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴增曲線為PRV陽性；被檢樣品Ct值大于30且小于37并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提取DNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判斷為陽性；被檢樣品Ct值大于或等于37時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判斷為陰性；Undetermined(Un)表示未檢測到熒光信號，結(jié)果判定為陰性。

1.2.3 PRRSV實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果判定標準 陽性對照Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，試驗結(jié)果成立，否則試驗結(jié)果無效，重測。

判斷標準：被檢樣品Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴增曲線為PRRSV陽性；被檢樣品Ct值大于30且小于37并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提取RNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍可疑，則判斷為陽性；被檢樣品Ct值大于或等于37時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判斷為陰性；Undetermined(Un)表示未檢測到熒光信號，判定為陰性。

1.2.4 豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果判定標準 陽性對照Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴增曲線，陰性對照無Ct值并且無特定擴增曲線，試驗結(jié)果成立，否則試驗結(jié)果無效，重測。

判斷標準：被檢樣品Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴增曲線為CSFV陽性；被檢樣品Ct值大于30且小于37并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需重新取樣提取RNA，擴增后進行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判斷為陽性；被檢樣品Ct值大于或等于37時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判斷為陰性；Undetermined(Un)表示未檢測到熒光信號，結(jié)果判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 偽狂犬病病毒gE抗體檢測結(jié)果

對采集的6頭50日齡～70日齡發(fā)病的保育豬和24頭經(jīng)產(chǎn)母豬的血清進行了偽狂犬病病毒gE抗體的ELISA檢測，結(jié)果詳見表1。由表1可知，30份樣品中有24份為陽性，6份為陰性；其中6份50日齡～70日齡發(fā)病保育豬樣品陽性率100%，24份經(jīng)產(chǎn)母豬樣品陽性率75%。

2.2 病毒核酸檢測結(jié)果

2.2.1 偽狂犬病病毒的檢測 分別取3頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織進行偽狂犬病病毒gE基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測(圖1和表2),3頭發(fā)病仔豬的腦和內(nèi)臟組織中偽狂犬病病毒gE基因檢測結(jié)果為陽性。

2.2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測 分別取3頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光定量PCR檢測，其中脾、肺和淋巴結(jié)組織混合為內(nèi)臟組織(圖2和表2),3頭發(fā)病仔豬的腦和內(nèi)臟組織的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結(jié)果為陰性。

2.2.3 豬瘟病毒的檢測 分別取3頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織進行豬瘟病毒野毒株實時熒光RT-PCR檢測(圖3和表2),3頭發(fā)病仔豬的腦和內(nèi)臟組織的豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測結(jié)果為陰性。

表1 偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測結(jié)果

Table 1 Detection results of gE antibody of pseudorabies virus by ELISA

類別Type數(shù)量Number陽性數(shù)Positive陽性率/%Positiverate保育豬Nurserypigs66100經(jīng)產(chǎn)母豬Prolificsows241875

圖1 偽狂犬病病毒gE基因?qū)崟r熒光定量PCR擴增

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光定量PCR擴增

圖3 豬瘟病毒實時熒光定量PCR擴增

表2 豬偽狂犬病病毒gE基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

Table 2 Detection results of gE gene of PRV 、porcine reproductive and respiratory syndrome virus、
classical swine fever virus by real-time PCR

樣品編號Sample№組織Tissue偽狂犬病病毒PRV豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV豬瘟病毒CSFV1腦Brain+--脾、肺和淋巴結(jié)Spleen,lungsandlymphnodes+--2腦Brain+--脾、肺和淋巴結(jié)Spleen,lungsandlymphnodes+--3腦Brain+--脾、肺和淋巴結(jié)Spleen,lungsandlymphnodes+--陽性對照PositiveControl/+++陰性對照NegativeControl/---

注：“+”陽性；“-”陰性；“/”未知。

Note:"+"Positive；"-"Negative；"/"Unknown.

3 討論

2011年至今，豬偽狂犬病又開始大范圍流行，對我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成巨大經(jīng)濟損失[3-5]。規(guī)?；i場普遍存在豬偽狂犬病病毒感染，陽性率為1.15%～16.98%[6]。偽狂犬病病毒在我國的豬場普遍存在，陽性率為34.1%，陽性豬場占檢測豬場總數(shù)的38.6%[7]。安徽地區(qū)規(guī)?；N豬場豬偽狂犬病血清學調(diào)查顯示，偽狂犬病病毒gE抗體陽性率為18.96%[8]。目前挪威、芬蘭和荷蘭等國已根除豬偽狂犬病，歐美等國的豬偽狂犬病也得到有效的控制[9]，而我國豬偽狂犬病并沒有得到有效的控制，主要是因為毒株的變異，廣西地區(qū)流行的偽狂犬病病毒與廣東、湖北等地流行的毒株gE基因核苷酸同源性很高，而與國內(nèi)經(jīng)典毒株遺傳關(guān)系較遠[10]。 豬偽狂犬病與豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等均可引起母豬流產(chǎn)和產(chǎn)死胎，在臨床癥狀上很難區(qū)分，且會與豬瘟等疾病混合感染[11-12]，通過ELISA方法檢測發(fā)病保育豬及母豬血清的偽狂犬病病毒gE抗體，采用實時熒光定量PCR方法進行偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒核酸檢測，最終排除豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的感染，從而確診該場此次發(fā)生的是豬偽狂犬病。 該場豬群每年進行4次豬偽狂犬病疫苗普免，依然發(fā)生了豬偽狂犬病疫情，其可能的原因主要有：現(xiàn)用疫苗毒株不能有效保護流行毒株，可能是由于流行毒株的變異造成；免疫效果不切實，可能與疫苗質(zhì)量不合格，疫苗的保存不當，免疫存在漏免等有關(guān)；生物安全方面存在隱患，如豬場未定期滅鼠，有較多的流浪貓或犬，引進后備豬時未能進行有效的檢疫等。建議該場在保證疫苗質(zhì)量及免疫操作的基礎(chǔ)上，加強飼養(yǎng)管理，注意觀察豬群狀態(tài)，定期進行抗體及病原的監(jiān)測，科學分析檢測數(shù)據(jù)，準確了解豬群的狀態(tài)，制定合理的免疫方案，避免盲目的免疫程序。該場豬偽狂犬病的發(fā)生也為新一代的疫苗的研發(fā)提出了新的要求。

疫苗免疫接種是控制豬偽狂犬病的有效措施，偽狂犬病病毒gE/gI/TK多基因缺失疫苗對仔豬和妊娠母豬健康狀況均無影響，安全性好，免疫保護率為100%[13]。因此，必須加強對該病防控的重視程度，采取有效地凈化措施。措施包括：禁止其他動物進入豬舍；定期滅鼠；實行自繁自養(yǎng)，嚴格執(zhí)行引種檢疫制度，對于引進的后備豬，必須檢測偽狂犬病病毒野毒抗體，并隔離觀察45 d，再進行第2次野毒抗體檢測，對檢測出的陽性豬進行生物安全處理；制定有效的疫苗免疫接種制度，對免疫接種后的豬群及時進行免疫效果檢測，并且定期對豬群進行偽狂犬病病毒野毒株gE基因抗體檢測，陽性者撲殺后進行生物安全處理[14]。豬偽狂犬病的凈化需要長期堅持對豬場采取以免疫預防為主的綜合措施，以防止豬偽狂犬病的發(fā)生。

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Diagnosis of Porcine Pseudorabies in a Large-scale Pig Farm

LI Chun-lu1,2，MA Wen-cai1，QIAO Ming-ming2，YANG Xin-yan2，ZHANG Yan-ming1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100；2.BeijingShijiYuanhengAnimalEpidemicPreventionTechnologyCo.Ltd，Beijing，100094)

Some sows appear serious abortion and stillbirth in a pig farm in Pingdingshan city Henan province，and 50-70 day old piglets appear neurological symptoms.According to the clinical manifestations,the disease was primarily diagnosed as pseudorabies.The laboratory diagnosis was done in order to exclude the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) and classical swine fever (CSF).The gE antibody in the sera to wild strain of pseudorabies virus was detected in nursery pigs and sows by ELISA，and sick piglet samples were detected for pseudorabies virus (PRV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and classical swine fever virus (CSFV) by real-time PCR.ELISA results showed that the pseudorabies virus antibody was positive,real-time PCR determined the pseudorabies virus nucleic acids was positive,but the nucleic acids of PRRSV and CSFV were negative in sick piglets.With a combination of clinical manifestations and laboratory tests,the definitive diagnosis was made as porcine pseudorabies in the farm.

Porcine pseudorabies; ELISA; real-time PCR; diagnosis

2016-04-18

李春祿(1979-),男,陜西寶雞人,碩士研究生,主要從事動物疫病防控工作。*通訊作者

S852.659.1

B

1007-5038(2016)12-0118-04