李春祿,馬文才,喬明明,楊欣艷,張彥明*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094)

某規(guī)?；i場(chǎng)偽狂犬病的診斷

李春祿1,2,馬文才1,喬明明2,楊欣艷2,張彥明1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司，北京 100094)

河南平頂山某豬場(chǎng)母豬出現(xiàn)較嚴(yán)重的流產(chǎn)和產(chǎn)死胎現(xiàn)象，且50日齡～70日齡仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，根據(jù)臨床表現(xiàn)初步診斷為偽狂犬病。為排除豬繁殖與呼吸綜合征和豬瘟，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷。應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)發(fā)病保育豬及母豬血清的偽狂犬病病毒野毒株gE抗體，并對(duì)發(fā)病仔豬病料進(jìn)行了偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，偽狂犬病病毒野毒抗體陽(yáng)性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)確定仔豬病料中PRV核酸陽(yáng)性，PRRSV和CSFV核酸陰性。結(jié)合臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確診該豬場(chǎng)發(fā)生的是豬偽狂犬病。

豬偽狂犬?。幻嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；診斷

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種急性傳染病。豬是偽狂犬病病毒的主要宿主和儲(chǔ)存者，除豬以外的其他動(dòng)物發(fā)病后通常具有發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等癥狀，均為致死感染。仔豬和其他易感動(dòng)物一旦感染該病，病死率較高[1]。PRV主要引起母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎，公豬不育，新生仔豬神經(jīng)癥狀和腹瀉[2]，與豬瘟(CSF)和豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)癥狀相似，極易誤診。因此，必須借助于實(shí)驗(yàn)室方法，才能夠?qū)υ摬∵M(jìn)行確診。

河南平頂山某規(guī)?；i場(chǎng)，基礎(chǔ)母豬存欄1 500頭，種豬群每年進(jìn)行4次豬偽狂犬病疫苗預(yù)防接種，初生仔豬進(jìn)行滴鼻免疫，肉豬55日齡進(jìn)行肌肉注射免疫1次；種豬群每年進(jìn)行3次豬瘟疫苗免疫接種，斷奶仔豬25日齡肌肉注射首免，60日齡加強(qiáng)免疫1次；豬場(chǎng)未進(jìn)行PRRS疫苗免疫接種。2014年12月下旬，該豬場(chǎng)母豬突然出現(xiàn)較嚴(yán)重的流產(chǎn)和死胎現(xiàn)象，且50日齡～70日齡仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，本文將診斷結(jié)果及報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集多頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織，6頭50日齡～70日齡發(fā)病的保育豬和24頭經(jīng)產(chǎn)母豬的血清。

1.1.2 試劑 偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒為法國(guó)LSI公司生產(chǎn)；偽狂犬病病毒gE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒等，均由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 PRV gE抗體檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算方法及判定標(biāo)準(zhǔn) 陰性對(duì)照OD值與陽(yáng)性對(duì)照OD值的差大于0.6，陽(yáng)性對(duì)照阻斷值大于60%，則試驗(yàn)成立，否則試驗(yàn)無(wú)效，重測(cè)。 用INH%來(lái)說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果，以下是計(jì)算方式。

INH%=[(陰性對(duì)照平均OD值-血清樣品的OD值)/(陰性對(duì)照平均OD值)]×100

判斷標(biāo)準(zhǔn)：INH%值大于45時(shí)，判斷樣品為PRV-gE抗體陽(yáng)性；INH%值大于或等于40且小于或等于45時(shí)，判斷樣品可疑，必須重測(cè)；INH%值小于40時(shí)，判斷樣品為PRV-gE抗體陰性。

1.2.2 PRV gE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果成立，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，重測(cè)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：被檢樣品Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)為PRV陽(yáng)性；被檢樣品Ct值大于30且小于37并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，需重新取樣提取DNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判斷為陽(yáng)性；被檢樣品Ct值大于或等于37時(shí)，超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判斷為陰性；Undetermined(Un)表示未檢測(cè)到熒光信號(hào)，結(jié)果判定為陰性。

1.2.3 PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果成立，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，重測(cè)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：被檢樣品Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)為PRRSV陽(yáng)性；被檢樣品Ct值大于30且小于37并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，需重新取樣提取RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍可疑，則判斷為陽(yáng)性；被檢樣品Ct值大于或等于37時(shí)，超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判斷為陰性；Undetermined(Un)表示未檢測(cè)到熒光信號(hào)，判定為陰性。

1.2.4 豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)Ct值并且無(wú)特定擴(kuò)增曲線(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果成立，否則試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，重測(cè)。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：被檢樣品Ct值小于或等于30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)為CSFV陽(yáng)性；被檢樣品Ct值大于30且小于37并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線(xiàn)，需重新取樣提取RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，則判斷為陽(yáng)性；被檢樣品Ct值大于或等于37時(shí)，超過(guò)本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判斷為陰性；Undetermined(Un)表示未檢測(cè)到熒光信號(hào)，結(jié)果判定為陰性。

2 結(jié)果

2.1 偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的6頭50日齡～70日齡發(fā)病的保育豬和24頭經(jīng)產(chǎn)母豬的血清進(jìn)行了偽狂犬病病毒gE抗體的ELISA檢測(cè)，結(jié)果詳見(jiàn)表1。由表1可知，30份樣品中有24份為陽(yáng)性，6份為陰性；其中6份50日齡～70日齡發(fā)病保育豬樣品陽(yáng)性率100%，24份經(jīng)產(chǎn)母豬樣品陽(yáng)性率75%。

2.2 病毒核酸檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 偽狂犬病病毒的檢測(cè) 分別取3頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織進(jìn)行偽狂犬病病毒gE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(圖1和表2),3頭發(fā)病仔豬的腦和內(nèi)臟組織中偽狂犬病病毒gE基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

2.2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè) 分別取3頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織進(jìn)行豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，其中脾、肺和淋巴結(jié)組織混合為內(nèi)臟組織(圖2和表2),3頭發(fā)病仔豬的腦和內(nèi)臟組織的豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。

2.2.3 豬瘟病毒的檢測(cè) 分別取3頭發(fā)病仔豬的腦、脾、肺和淋巴結(jié)組織進(jìn)行豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)(圖3和表2),3頭發(fā)病仔豬的腦和內(nèi)臟組織的豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性。

表1 偽狂犬病病毒gE抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

Table 1 Detection results of gE antibody of pseudorabies virus by ELISA

類(lèi)別Type數(shù)量Number陽(yáng)性數(shù)Positive陽(yáng)性率/%Positiverate保育豬Nurserypigs66100經(jīng)產(chǎn)母豬Prolificsows241875

圖1 偽狂犬病病毒gE基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

圖2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

圖3 豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

表2 豬偽狂犬病病毒gE基因、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

Table 2 Detection results of gE gene of PRV 、porcine reproductive and respiratory syndrome virus、
classical swine fever virus by real-time PCR

樣品編號(hào)Sample№組織Tissue偽狂犬病病毒PRV豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV豬瘟病毒CSFV1腦Brain+--脾、肺和淋巴結(jié)Spleen,lungsandlymphnodes+--2腦Brain+--脾、肺和淋巴結(jié)Spleen,lungsandlymphnodes+--3腦Brain+--脾、肺和淋巴結(jié)Spleen,lungsandlymphnodes+--陽(yáng)性對(duì)照PositiveControl/+++陰性對(duì)照NegativeControl/---

注：“+”陽(yáng)性；“-”陰性；“/”未知。

Note:"+"Positive；"-"Negative；"/"Unknown.

3 討論

2011年至今，豬偽狂犬病又開(kāi)始大范圍流行，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。規(guī)?；i場(chǎng)普遍存在豬偽狂犬病病毒感染，陽(yáng)性率為1.15%～16.98%[6]。偽狂犬病病毒在我國(guó)的豬場(chǎng)普遍存在，陽(yáng)性率為34.1%，陽(yáng)性豬場(chǎng)占檢測(cè)豬場(chǎng)總數(shù)的38.6%[7]。安徽地區(qū)規(guī)模化種豬場(chǎng)豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查顯示，偽狂犬病病毒gE抗體陽(yáng)性率為18.96%[8]。目前挪威、芬蘭和荷蘭等國(guó)已根除豬偽狂犬病，歐美等國(guó)的豬偽狂犬病也得到有效的控制[9]，而我國(guó)豬偽狂犬病并沒(méi)有得到有效的控制，主要是因?yàn)槎局甑淖儺?，廣西地區(qū)流行的偽狂犬病病毒與廣東、湖北等地流行的毒株gE基因核苷酸同源性很高，而與國(guó)內(nèi)經(jīng)典毒株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)[10]。 豬偽狂犬病與豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等均可引起母豬流產(chǎn)和產(chǎn)死胎，在臨床癥狀上很難區(qū)分，且會(huì)與豬瘟等疾病混合感染[11-12]，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)發(fā)病保育豬及母豬血清的偽狂犬病病毒gE抗體，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒核酸檢測(cè)，最終排除豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的感染，從而確診該場(chǎng)此次發(fā)生的是豬偽狂犬病。 該場(chǎng)豬群每年進(jìn)行4次豬偽狂犬病疫苗普免，依然發(fā)生了豬偽狂犬病疫情，其可能的原因主要有：現(xiàn)用疫苗毒株不能有效保護(hù)流行毒株，可能是由于流行毒株的變異造成；免疫效果不切實(shí)，可能與疫苗質(zhì)量不合格，疫苗的保存不當(dāng)，免疫存在漏免等有關(guān)；生物安全方面存在隱患，如豬場(chǎng)未定期滅鼠，有較多的流浪貓或犬，引進(jìn)后備豬時(shí)未能進(jìn)行有效的檢疫等。建議該場(chǎng)在保證疫苗質(zhì)量及免疫操作的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意觀察豬群狀態(tài)，定期進(jìn)行抗體及病原的監(jiān)測(cè)，科學(xué)分析檢測(cè)數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確了解豬群的狀態(tài)，制定合理的免疫方案，避免盲目的免疫程序。該場(chǎng)豬偽狂犬病的發(fā)生也為新一代的疫苗的研發(fā)提出了新的要求。

疫苗免疫接種是控制豬偽狂犬病的有效措施，偽狂犬病病毒gE/gI/TK多基因缺失疫苗對(duì)仔豬和妊娠母豬健康狀況均無(wú)影響，安全性好，免疫保護(hù)率為100%[13]。因此，必須加強(qiáng)對(duì)該病防控的重視程度，采取有效地凈化措施。措施包括：禁止其他動(dòng)物進(jìn)入豬舍；定期滅鼠；實(shí)行自繁自養(yǎng)，嚴(yán)格執(zhí)行引種檢疫制度，對(duì)于引進(jìn)的后備豬，必須檢測(cè)偽狂犬病病毒野毒抗體，并隔離觀察45 d，再進(jìn)行第2次野毒抗體檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出的陽(yáng)性豬進(jìn)行生物安全處理；制定有效的疫苗免疫接種制度，對(duì)免疫接種后的豬群及時(shí)進(jìn)行免疫效果檢測(cè)，并且定期對(duì)豬群進(jìn)行偽狂犬病病毒野毒株gE基因抗體檢測(cè)，陽(yáng)性者撲殺后進(jìn)行生物安全處理[14]。豬偽狂犬病的凈化需要長(zhǎng)期堅(jiān)持對(duì)豬場(chǎng)采取以免疫預(yù)防為主的綜合措施，以防止豬偽狂犬病的發(fā)生。

[1] 甘孟侯，楊漢春.中國(guó)豬病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：177.

[2] 周慧英，程 藝，孫磊磊，等.偽狂犬病病毒EPO基因的克隆及原核表達(dá)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,34(4)：4-8.

[3] An T Q，Peng J M，Tian Z J，et al.Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs,China,2012[J].Emerg Infect Dis，2013，19(11)：1749-1755.

[4] Wang C H，Yuan J，Qin H Y，et al.A novel gE-deleted pseudorabies virus (PRV) provides rapid and complete protection from lethal challenge with the PRV variant emerging in Bartha-K61-vaccinated swine population in China[J].Vaccine，2014，32(27)：3379-3385.

[5] Yu X，Zhou Z，Hu D，et al.Pathogenic pseudorabies virus,China[J].Emerg Infect Dis，2014，20(1)：102-104.

[6] 諶 磊，劉 峰，黃青偉.河南地區(qū)豬偽狂犬病流行現(xiàn)狀及防控策略[J].北方牧業(yè)，2014(7)：18.

[7] 張顯浩，陳瑞愛(ài)，李 冰，等.2012年-2013年我國(guó)集約化豬場(chǎng)豬偽狂犬病病毒感染情況的調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015,36(3):133-136.

[8] 占松鶴，劉 華，周迎春，等.安徽省規(guī)?；i場(chǎng)豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015,36(3):124-127.

[9] 林群群，鄭小香，陳秋勇，等.豬偽狂犬病病毒NP株的分離鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015,36(3)：59-63.

[10] 覃雨陽(yáng)，李雪梅，馬 軍，等.廣西地區(qū)豬偽狂犬病病毒gE基因的序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016,37(1)：17-21.

[11] 吳憶春.某豬場(chǎng)豬偽狂犬病病毒與豬瘟病毒混合感染的診斷[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014,35(6)：171-174.

[12] 宋宏曉，李蔥曉，王 慧，等.河南省部分地區(qū)豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒核酸監(jiān)測(cè)分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013,34(2)：117-121.

[13] 呂素芳，郭廣君，魏 鳳，等.豬偽狂犬病病毒gE-/gI-/TK-多基因缺失活疫苗對(duì)豬的安全性和免疫力研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014,35(4)：1-5.

[14] 牛建強(qiáng)，藍(lán) 天，羅旭芳，等.規(guī)模化豬場(chǎng)偽狂犬病的控制和凈化[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006，33(7)：58-59.

Diagnosis of Porcine Pseudorabies in a Large-scale Pig Farm

LI Chun-lu1,2，MA Wen-cai1，QIAO Ming-ming2，YANG Xin-yan2，ZHANG Yan-ming1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100；2.BeijingShijiYuanhengAnimalEpidemicPreventionTechnologyCo.Ltd，Beijing，100094)

Some sows appear serious abortion and stillbirth in a pig farm in Pingdingshan city Henan province，and 50-70 day old piglets appear neurological symptoms.According to the clinical manifestations,the disease was primarily diagnosed as pseudorabies.The laboratory diagnosis was done in order to exclude the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) and classical swine fever (CSF).The gE antibody in the sera to wild strain of pseudorabies virus was detected in nursery pigs and sows by ELISA，and sick piglet samples were detected for pseudorabies virus (PRV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and classical swine fever virus (CSFV) by real-time PCR.ELISA results showed that the pseudorabies virus antibody was positive,real-time PCR determined the pseudorabies virus nucleic acids was positive,but the nucleic acids of PRRSV and CSFV were negative in sick piglets.With a combination of clinical manifestations and laboratory tests,the definitive diagnosis was made as porcine pseudorabies in the farm.

Porcine pseudorabies; ELISA; real-time PCR; diagnosis

2016-04-18

李春祿(1979-),男,陜西寶雞人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物疫病防控工作。*通訊作者

S852.659.1

B

1007-5038(2016)12-0118-04