朱玲云，張正學(xué)，鄭龍龍，劉萍丹，畢峻龍，趙 謙，劉 佳，楊貴樹(shù)，尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000)

獸醫(yī)臨床

山羊源偽狂犬病病毒的分離與鑒定

朱玲云1，張正學(xué)1，鄭龍龍1，劉萍丹1，畢峻龍2，趙 謙1，劉 佳1，楊貴樹(shù)1，尹革芬1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南楚雄 675000)

為確診一例發(fā)病山羊是否感染偽狂犬病病毒，采集發(fā)病羊體的肺臟和腦組織進(jìn)行偽狂犬病病毒gE基因PCR檢測(cè)，并將病料接種至PK-15細(xì)胞分離病毒，以及進(jìn)行小鼠感染試驗(yàn)和gD基因分析。結(jié)果表明，PCR檢測(cè)結(jié)果PRV陽(yáng)性，病料接種PK-15細(xì)胞24 h后，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變；將病毒感染小鼠，36 h后小鼠出現(xiàn)局部奇癢、死亡； gD基因序列分析發(fā)現(xiàn)，分離毒株與GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98% 以上，氨基酸同源性在99% 以上；在分離毒株 gD基因的808 bp～837 bp位置上存在缺失與變異、高變重復(fù)區(qū)。本研究成功分離獲得一株羊源偽狂犬病毒，為云南省羊偽狂犬病防控和基礎(chǔ)研究提供資料。

偽狂犬病病毒；PCR鑒定；PK-15細(xì)胞；基因分析；山羊

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)具有廣泛的宿主譜，可感染多種哺乳動(dòng)物，包括反芻動(dòng)物、食肉動(dòng)物和嚙齒類動(dòng)物等，可引起家畜和多種野生動(dòng)物出現(xiàn)以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。豬是主要貯存宿主和傳染源，可引起母豬繁殖障礙、新生仔豬神經(jīng)癥狀等[1]。PRV感染野生動(dòng)物也多有報(bào)道。2012年某動(dòng)物園美洲虎發(fā)生PRV感染，感染虎出現(xiàn)厭食，委頓，渴欲增加，偶見(jiàn)咳嗽、后肢運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀[2]。芮萍等[3]從多個(gè)毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)不同日齡出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、腹瀉或急性死亡的貂上采集腦組織，接種細(xì)胞分離到1株P(guān)RV。

羊也可感染PRV，冒銀祥等[4]報(bào)道，河北省遵化市肉羊養(yǎng)殖場(chǎng)12 只羊出現(xiàn)精神沉郁、發(fā)熱、轉(zhuǎn)圈、磨牙，有時(shí)用頭嘴蹭地，食欲減退等臨床癥狀，個(gè)別羊還會(huì)出現(xiàn)咳嗽、腹瀉癥狀，最后鑒定為PRV感染。2014年10月，云南省石林地區(qū)某養(yǎng)殖戶山羊出現(xiàn)劇癢及腦脊髓炎等臨床癥狀，與冒銀祥報(bào)道的病例相似，病羊不斷摩擦鼻鏡，用蹄子蹭腹部，在地面上磨擦肛門，皮膚脫毛、水腫，甚至出血，個(gè)別羊出現(xiàn)磨齒，后足用力踏地，并表現(xiàn)間歇性煩躁不安等癥狀，站立不穩(wěn)、震顫，甚至不能站立，大量流涎等癥狀，最后死亡。根據(jù)臨床癥狀，初步懷疑為羊PRV感染，為了進(jìn)一步證實(shí)臨床診斷結(jié)果，進(jìn)行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40日齡、體重20 g的Balb/c小鼠12只，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)。

1.1.2 樣品來(lái)源 無(wú)菌采集病羊肺臟和腦組織， 病羊臨床呈現(xiàn)體表脫毛、破皮和出血，臥地不起、四肢麻痹，臨死前四肢做劃水樣運(yùn)動(dòng)、死亡時(shí)出現(xiàn)抽搐，死亡后角弓反張病料保存于-80℃冰箱中，以備檢測(cè)使用。

1.1.3 細(xì)胞以及相關(guān)試劑 PK-15細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM、胎牛血清、雙抗、胰酶為HyClone公司產(chǎn)品； DNA提取試劑盒為百泰克生物股份有限公司產(chǎn)品；自配PBS；其他化學(xué)試劑由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)教學(xué)中心傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.4 引物 根據(jù)GenBank中PRV基因參考序列JQ809328.1，應(yīng)用Oligo6.0軟件分別設(shè)計(jì)了針對(duì)gD全基因和gE基因特異性引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1 263 bp和500 bp，并送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成，其引物序列見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 病料組織提取DNA 無(wú)菌條件取腦組織和肺臟剪碎后，用組織研磨棒研碎，并用百泰克公司的組織DNA提取試劑盒提取病料總DNA。提取好的DNA用PRV gE基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，初步檢測(cè)病料中是否含有PRV。

1.2.2 病料組織勻漿接種細(xì)胞 無(wú)菌條件分別取腦組織和肺臟組織剪碎后，用組織研磨棒研碎，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，制成組織勻漿，置于-80℃冰箱里反復(fù)凍融3次；10 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液加入100 μL雙抗，4℃靜置30 min；用0.22 μm一次性濾器過(guò)濾除菌，取800 μL組織勻漿過(guò)濾液接種至80%單層PK-15細(xì)胞(6孔板)，37 ℃感作1 h；加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；逐日觀察細(xì)胞病變。連續(xù)傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的時(shí)間穩(wěn)定時(shí)，終止傳代培養(yǎng)，于-80℃冰箱中保存病毒培養(yǎng)物。

表1 PRV gD及gE基因引物序列

Table 1 gD and gE gene primer sequences of PRV

引物名稱Primername引物序列(5'→3')Primersequence片段長(zhǎng)度Fragmentlength擴(kuò)增基因AmplifiedgenegD-FCCCCAGGTTCCCATACACTC1263bpgDgD-RTCATCATCGACGCCGGTACTgE-nFCCGCGGGCCGTGTTCTTTGT500bpgEgE-nRCGTGGCCGTTGTGGGTCAT

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50測(cè)定 用PK-15細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，并用Reed-Muench兩氏法計(jì)算分離病毒的TCID50。

1.2.4 小鼠感染 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行蝕斑純化和純凈性檢測(cè)，將細(xì)胞培養(yǎng)物皮下注入40日齡體重相近的Balb/c小鼠體內(nèi)，雌雄各半將其分為2組(A、B組)，每組小鼠6只。分房間飼養(yǎng)，自由采食飲水。A組小鼠腹側(cè)皮下分3個(gè)不同部位注射200 μL病毒液，B組小鼠腹側(cè)皮下分3個(gè)不同部位注射200 μL生理鹽水作為空白對(duì)照。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)物提取DNA及其基因擴(kuò)增及測(cè)序 取90%以上細(xì)胞病變的培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次。取200 μL置于DEPC水處理過(guò)的1.5 mL滅菌離心管中，用病毒DNA小量試劑盒提取病毒DNA。取病毒基因組DNA進(jìn)行g(shù)D基因擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)管依次加入滅菌ddH2O 10.5 μL，10×GC Enhancer 7.5 μL，dNTPs 2.0 μL，TransTaqHiFi DNA polymerase 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，10×TransTaqHiFi buffer Ⅱ 2.5 μL，DNA 1.0 μL。gD基因擴(kuò)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用15 g/L的TAE瓊脂糖凝膠電泳，回收擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.6 基因序列分析 采用Megaligan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)，將測(cè)序序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中已提交的豬PRV毒株的gD基因進(jìn)行同源性分析比較，并利用MEGA5.2分析軟件Clustal W法對(duì)該測(cè)序序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)的繪制，從而進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒PCR鑒定

提取病料組織的DNA并進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。送檢病料檢測(cè)PRV gE基因，預(yù)期目的片段長(zhǎng)度為500 bp，電泳結(jié)果大小符合目的片段長(zhǎng)度(圖1)，初步判定該山羊感染PRV。

M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對(duì)照；2.送檢病樣PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control; 2.Detected sample PCR products

圖1 PRV的gE基因PCR擴(kuò)增電泳圖

Fig.1 PCR detection of PRV gE gene in detected sample

2.2 病毒分離鑒定

組織勻漿過(guò)濾液接種PK-15細(xì)胞，細(xì)胞在24 h開(kāi)始出現(xiàn)圓縮、聚集，48 h開(kāi)始慢慢脫落(圖2)。細(xì)胞所出現(xiàn)的CPE變化符合PRV接種PK-15細(xì)胞的CPE變化[5]。

2.3 病毒TCID50測(cè)定

取分離株連續(xù)培養(yǎng)至第5代的病毒，在PK-15細(xì)胞上測(cè)定TCID50，按Reed-Muench法進(jìn)行計(jì)算。經(jīng)計(jì)算，本次分離的PRV分離株的TCID50為5.6×105/0.1 mL。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

注射了細(xì)胞培養(yǎng)物的A組小鼠在36 h時(shí)出現(xiàn)精神萎靡，48 h時(shí)小鼠焦躁不安，不停舔舐注射部位，腹部脫毛，出血；小鼠60 h時(shí)死亡1只，72 h時(shí)死亡4只，84 h時(shí)死亡1只。B組小鼠在試驗(yàn)過(guò)程

中精神正常，采食飲水正常，未發(fā)現(xiàn)異常癥狀。上述小鼠癥狀的描述符合PRV感染小鼠的癥狀[6]。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)物DNA提取及基因擴(kuò)增

取90%以上病變的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行DNA提取，以提取物為模板，進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增獲得目片段，大小約為1 263 bp(圖3)。判定細(xì)胞培養(yǎng)物中含有PRV，并將其命名為YN-S2014。

A.病料接種PK-15細(xì)胞；B.PK-15正常細(xì)胞

A.PK-15 cells inoculated with PRV material; B.Normal PK-15 cells

圖2 疑似PRV感染料接種PK-15細(xì)胞

Fig.2 PK-15 cells inoculation with suspected PRV material

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； 1.PRV gD基因；2.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PRV gD gene; 2.Negative control

圖3 PRV的gD基因PCR擴(kuò)增的物電泳圖

Fig.3 Electrophoresis of PCR products of PRV gD gene

2.6 gD基因序列分析

擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒gD基因，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序測(cè)序。將獲得基因序列與參考毒株基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果如圖4所示，分離株gD基因序列與GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上；分離株gD基因序列在808-837 bp位置存在缺失與變異(圖4)，存在高變重復(fù)區(qū)。分離株gD氨基酸序列與GenBank中的PRV gD氨基酸同源性均在98%以上。

將分離株gD基因序列與從GenBank下載的部分基因序列用MEGA5.2分析軟件Clustal W法繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，獲得圖5結(jié)果，顯示分離株YN-S2014株與LY、TJ、HeN1、BJ株等豬源PRV的變異較小，屬同一分支；與NYT、Kaplan、LA、Min-A、PRV-FZ的gD核苷酸序列變異率較高，屬不同分支。

3 討論

從疑似PRV的1份羊病料組織中分離鑒定了1株P(guān)RV，命名為YN-S2014株；通過(guò)PCR同時(shí)檢測(cè)到gE和gD基因的存在，排除了疫苗毒株的可能性，證實(shí)本研究分離到的毒株是野毒，而非疫苗毒。云南省石林地區(qū)未曾有PRV gD基因的分析報(bào)道，本研究對(duì)gD 基因核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析結(jié)果顯示，YN-S2014株與LY、QBA、TJ、HeN1、BJ株等豬源PRV株的變異較小(99%～100%)，屬同一分支。目前，PRV 仍然是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病病原之一，每年造成的數(shù)以萬(wàn)計(jì)經(jīng)濟(jì)損失。但是對(duì)于PRV 的病毒演變、遺傳變異等諸多方面的研究還不是非常清楚。為了能夠在分子水平對(duì)PRV 進(jìn)行研究分析，我們選擇了1株中國(guó)毒株對(duì)其主要抗原蛋白基因gD 基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，連同目前GenBank 登錄的15株病毒基因序列，利用生物信息學(xué)的方法試圖了解其基因變異和抗原變異的關(guān)系，以及云南省該株羊源PRV 基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)情況等內(nèi)容。而從氨基酸同源性看，該蛋白氨基酸同源性差異很小，說(shuō)明基因中變異區(qū)-高變重復(fù)區(qū)對(duì)于蛋白質(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)造成的影響很小，暗示PRV 抗原具有相對(duì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖4 測(cè)序序列同源性BLAST比對(duì)結(jié)果

Fig.4 Alignment results of sequence homology by BLAST

圖5 PRV分離株gD基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

Fig.5 Phylogenetic tree analysis of PRV gD gene

目前，云南省內(nèi)尚未報(bào)道有羊感染PRV的病例。自2001年以來(lái)，四川省、河北省先后報(bào)道有羊感染PRV的病例[7-9]。該研究首次對(duì)云南省羊源PRV進(jìn)行毒株分離鑒定，為后續(xù)研究及疫苗選擇提供材料。對(duì)gD 基因核苷酸序列繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，分析結(jié)果可以初步推測(cè)羊PRV與豬PRV毒株間變異較小，對(duì)該病的預(yù)防提供了一定理論基礎(chǔ)。

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Isolation and Identification of PRV from Goat

ZHU Ling-yun1,ZHANG Zheng-xue1,ZHENG Long-long1, LIU Ping-dan1,BI Jun-long2, ZHAO Qian1, LIU Jia1, YANG Gui-shu1, YIN Ge-fen1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China; 2.ChuxiongAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Chuxiong,Yunnan,675000,China)

To detect whether a goat was infected with pseudorabies, the lung and brain of the diseased sheep were collected to carry out the PCR detection of gE gene of the pseudorabies virus; and the material was inoculated into PK-15 cells to isolate the virus; as the same time,the mice infection test and gD gene analysis were made. The result of PCR showed that PRV was positive. After 24 hours of inoculation, the cells began to show cytopathic effect; the mice infected with virus showed partial itching and death after 36 hours.Furthermore,gD gene sequence analysis showed that the homology of PRV gD gene in GenBank was more than 98% and the homology of amino acid was more than 99%. The deletion and mutation of gD gene in 808 bp-837 bp locus were found in the isolates. In this study,pseudorabies virus was successfully isolated from the goat, which provided data and basic research for prevention and control of goat pseudorabies virus in Yunnan province.

Pseudorabies virus;PCR identification;PK-15 cell; gene analysis;goat

2015-10-15

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)項(xiàng)目(31160509)

朱玲云(1991-)，女，云南保山人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)與分子流行病學(xué)研究。 *通訊作者

S852.659.1

B

1007-5038(2016)12-0113-05