鄭文蘭 楊江燕 文曉敏 陳歡歡

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.綏陽(yáng)縣中醫(yī)院， 貴州 綏陽(yáng) 563300)

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加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞及肝臟的影響

鄭文蘭1楊江燕2文曉敏1陳歡歡1

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002；2.綏陽(yáng)縣中醫(yī)院， 貴州 綏陽(yáng) 563300)

目的 觀察加味宮外孕Ⅱ號(hào)方對(duì)早孕大鼠滋養(yǎng)細(xì)胞及肝臟的影響。方法 將早孕大鼠分為西藥組(甲氨蝶呤)、中藥(加味宮外孕Ⅱ號(hào)方)低、中、高劑量組、中西藥結(jié)合組和空白組(生理鹽水)，分別予甲氨蝶呤肌注、中藥或生理鹽水灌胃，第8天處死孕鼠取血、肝臟、子宮及孕囊，檢測(cè)血β-HCG,觀察滋養(yǎng)細(xì)胞及肝臟組織病理學(xué)改變。結(jié)果 與空白組比較，另5組出現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常、破壞，線粒體腫脹，核異染色質(zhì)增多，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及血β-HCG下降，以中藥高劑量組和中西藥結(jié)合組較明顯，與其他3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥中劑量與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除中藥低劑量組外，另外幾組孕鼠肝臟病理學(xué)評(píng)分上升，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，西藥組和中西藥結(jié)合組上升明顯，與中藥高、中劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 加味宮外孕Ⅱ號(hào)方通過(guò)影響孕鼠滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能而達(dá)到損壞胚胎目的，且存在量效關(guān)系，劑量增高作用增強(qiáng)；而對(duì)孕鼠肝損害較甲氨蝶呤輕。

加味宮外孕Ⅱ號(hào)方 早孕大鼠 滋養(yǎng)細(xì)胞 肝損害

異位妊娠(EP)是婦科常見(jiàn)的急腹癥，是孕產(chǎn)婦死亡的原因之一，發(fā)病率約2 %，病死率占孕婦死亡總數(shù)的9 %～10 %[1-2]，嚴(yán)重威脅育齡期婦女的生命安全及生殖功能。本院自2000年開始EP的藥物保守治療，經(jīng)臨床實(shí)踐，篩選出一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的中藥協(xié)定處方即加味宮外孕Ⅱ號(hào)方，其保守治療成功率86.7%[3]，廣泛應(yīng)用于臨床17年，但其殺胚作用機(jī)理及對(duì)肝臟的影響尚不清楚。而輸卵管妊娠目前仍未能建立EP動(dòng)物模型，故本研究以早孕大鼠為模型，探索該方對(duì)妊娠滋養(yǎng)葉細(xì)胞及肝臟的影響，以進(jìn)一步探討其作用機(jī)制及副作用，間接為中醫(yī)藥保守治療EP提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠共110只，其中性成熟未生育雌性大鼠80只，體質(zhì)量(260±10) g；性成熟雄性大鼠30只，體質(zhì)量(280±10) g。由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK-(渝)2012-0005。

1.2 藥物與試劑

加味宮外孕Ⅱ號(hào)方組成：丹參15 g、桃仁9 g、赤芍15 g、莪術(shù)9 g、三棱 9 g、全蝎10 g、土鱉蟲10 g、蜈蚣9 g、紫草25 g，以上中藥購(gòu)于貴州省中醫(yī)院，由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院制劑室制備成濃度為每毫升含生藥6 g(高劑量)、3 g(中劑量)、1.5 g(低劑量)的3種藥液，分別裝瓶標(biāo)記，置于4 ℃冰箱冷藏備用；甲氨喋呤(MTX)由山西普德藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)H14022462；HCG(絨毛膜促性腺激素)試劑盒由云南諾貝生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 動(dòng)物模型制備

造模方法參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]：取雌鼠陰道分泌物作脫落細(xì)胞檢查，觀察2周，剔除無(wú)動(dòng)情周期雌鼠16只，將雄鼠與動(dòng)情期的雌鼠按1∶1比例合籠，次晨取雌鼠陰道分泌物鏡檢，查見(jiàn)精子為妊娠第1天。

1.4 動(dòng)物分組與給藥

將交配成功的孕鼠隨機(jī)編號(hào)分為6組(每組8只)：西藥組、中西藥結(jié)合組和中藥低、中、高劑量組、空白組。經(jīng)計(jì)算每只大鼠加味宮外孕Ⅱ號(hào)方給藥容積為0.777 mL/(100 g·d)，MTX給藥劑量為0.777 5 mg/100 g。給藥時(shí)間為上午09：00-10：00。

西藥組：妊娠第1天按0.777 5 mg/100 g體質(zhì)量肌注MTX，1次為1個(gè)療程，以后不再給藥，并同時(shí)按0.777 mL/100 g體質(zhì)量予生理鹽水灌胃，1次/d。中藥高、中、低劑量組：妊娠第1天起按0.777 mL/100 g體質(zhì)量分別給予高、中、低劑量的加味宮外孕Ⅱ號(hào)方灌胃，1次/d。中西藥結(jié)合組：妊娠第1天起予中劑量加味宮外孕Ⅱ號(hào)方灌胃及MTX肌注。方法同西藥組及中藥組?？瞻捉M：妊娠第1天起按0.777 mL/100 g體質(zhì)量予0.9%生理鹽水灌胃，1次/d。中藥及生理鹽水灌胃均連續(xù)用7 d。

1.5 標(biāo)本收集與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 標(biāo)本收集 用藥后第7天晚8點(diǎn)開始禁飲食，次晨8：00處死大鼠。同時(shí)取股動(dòng)脈血5 mL，室溫下靜置1 h，以3 000r/min離心15 min，收集血清置-80 ℃冰箱備用。迅速取出大鼠肝臟及部分妊娠子宮,用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋HE染色作光鏡檢查用。將另一部分妊娠子宮切成大小為1 mm×1 mm的組織塊，放入2.5%戊二醛溶液中，固定24 h制片作電鏡檢查用。

1.5.2 檢測(cè)大鼠血β-HCG值 從冰箱中取出備用的血清并在室溫下解凍。采用ELISA法按HCG試劑盒說(shuō)明書的方法測(cè)定孕鼠血清的HCG值。

1.5.3 孕鼠肝臟組織病理學(xué)檢查 肝臟組織病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)分參照文獻(xiàn)[5] 擬定：(1)肝細(xì)胞脂肪變性:包括大泡性脂變和小泡性脂變，無(wú)(-)；散在(+)；片狀病變<33%或限于肝腺泡Ⅲ區(qū)(++)；片狀病變33%～66%或達(dá)到肝腺泡Ⅱ區(qū)(+++)；彌漫性病變>66%或達(dá)到肝腺泡Ⅰ區(qū)(++++)。(2)肝小葉內(nèi)炎癥、壞死：無(wú)(-)；散在小壞死灶(+)；片狀壞死灶(++)；大壞死灶，彌漫存在于肝小葉(+++)；橋接壞死(++++)。(3)纖維化：中央靜脈或匯管區(qū)周圍輕度纖維化(Ⅰ級(jí))；中央靜脈間有纖維隔形成，但尚未連接成環(huán)(Ⅱ級(jí))；中央靜脈間纖維隔相連成環(huán)形，匯管區(qū)位于其中央(Ⅲ級(jí))；中央靜脈間纖維隔相連成環(huán)形，匯管區(qū)位于其中央，并且在中央靜脈和匯管區(qū)之間出現(xiàn)纖維隔(Ⅳ級(jí))；病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):(-)記0分； (+、Ⅰ級(jí))各記1分；(++、Ⅱ級(jí))各記2分；(+++、Ⅲ級(jí))各記3分；(++++、Ⅳ級(jí))各記4分。以上3項(xiàng)合計(jì)為總評(píng)分。

1.5.4 滋養(yǎng)細(xì)胞及孕囊組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6] 擬定：0 分,胚囊及滋養(yǎng)細(xì)胞正常形態(tài)完全消失，無(wú)或少量壞死組織殘留； 1分,滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量大量減少(90%)，部分胚囊及壞死組織殘留； 2分,滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量減少(60%)，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胚囊正常形態(tài)破壞； 3分,滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量減少(30%)，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胚囊完整； 4分,滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育良好，胚囊完整。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 孕鼠肝臟組織病理學(xué)改變

甲氨蝶呤及中藥加味宮外孕Ⅱ號(hào)方均可使孕鼠肝臟出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞水腫，脂肪空泡分布，匯管區(qū)、小葉中央靜脈和間質(zhì)見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生，肝臟組織病理學(xué)評(píng)分見(jiàn)表1。低劑量組與空白組、中劑量組與高劑量組、西藥組與中西藥結(jié)合組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別孕鼠數(shù)肝臟組織病理學(xué)評(píng)分分布/只0136912總評(píng)分空白組88000000.00±0西藥組80033116.00±3.2*■△中西藥結(jié)合組80034105.25±2.1*■□△中藥中劑量組81322002.63±2.3*▲△○中藥高劑量組80232104.00±2.8*▲△○中藥低劑量組86110000.50±1.7

注：與空白組比較，*P<0.05；與中劑量組比較，■P<0.05；與高劑量組比較，□P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與西藥組比較，▲P<0.05；與結(jié)合組比較，○P<0.05。

2.2 6組孕鼠血β-HCG變化

6組孕鼠的血β-HCG見(jiàn)表2，西藥組與中藥中劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別動(dòng)物數(shù)/只β-HCG/(mIU/mL)空白組西藥組88 16.6±3.639.08±3.27*○□△中西藥結(jié)合組8 3.86±1.72*▲■□△中藥中劑量組8 8.55±4.10*□△○中藥高劑量組中藥低劑量組88 6.72±2.45*△▲○■ 11.47±4.29*▲○■□

注：與空白組比較，*P<0.05;與中劑量組比較，■P<0.05;與高劑量組比較，□P<0.05;與低劑量組比較，△P<0.05;與西藥組比較，▲P<0.05;與結(jié)合組比較,○P<0.05。

2.3 6組孕鼠妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞病理評(píng)分

空白組滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊、體積正常、可見(jiàn)完整的胚囊組織；其他5組均出現(xiàn)不同程度的滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)不清、體積變小，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，胚囊的正常組織結(jié)構(gòu)被破壞或消失，壞死組織殘留。見(jiàn)圖1。滋養(yǎng)細(xì)胞組織病理學(xué)評(píng)分西藥組和中藥中、低劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中西藥結(jié)合組和中藥高劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

圖1 各組孕鼠妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞組織病理學(xué)改變

組別孕鼠數(shù)滋養(yǎng)葉細(xì)胞病理評(píng)分分布01234評(píng)分空白組8000084.00±0西藥組中西藥結(jié)合組8815222120102.001±1.3*○□0.50±0.8*■△▲中藥中劑量組8221121.88±1.6*□○中藥高劑量組中藥低劑量組8830312302020.88±0.8*△■▲2.50±0.9*□○

注：與空白組比較，*P<0.05；與中劑量組比較，■P<0.05；與高劑量組比較，□P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與西藥組比較，▲P<0.05；與結(jié)合組比較，○P<0.05。

2.4 6組孕鼠滋養(yǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

空白組：核仁呈圓形，核膜界限清楚，核質(zhì)內(nèi)染色質(zhì)均勻，胞漿內(nèi)布滿正常細(xì)胞器；西藥組：細(xì)胞核無(wú)明顯異常，異染色質(zhì)邊集于細(xì)胞膜，部分線粒體空泡化；結(jié)合組：細(xì)胞與細(xì)胞之間的間隙明顯較正常寬，可見(jiàn)不規(guī)則細(xì)胞核形狀，細(xì)胞核內(nèi)布滿顏色較深的異染色質(zhì)，并邊集于細(xì)胞膜，胞漿內(nèi)細(xì)胞器較正常少，可見(jiàn)空泡化線粒體；中藥中劑量組：細(xì)胞核形狀較不規(guī)則，異染色質(zhì)增多，線粒體腫脹；低劑量組：細(xì)胞核正常，線粒體腫脹；高劑量組：整個(gè)細(xì)胞腫脹，胞漿稀疏，線粒體腫脹，脊斷裂或消失。

3 討 論

中醫(yī)認(rèn)為異位妊娠本質(zhì)是血瘀少腹，其治則為活血?dú)⑴呦Y，本院所用加味宮外孕Ⅰ號(hào)方是在宮外孕Ⅱ號(hào)方(丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù))的基礎(chǔ)上加蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草等。原方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術(shù)具活血化瘀消癥之功，而蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草有破血、殺胚的作用,全方共奏活血?dú)⑴呦Y之效。MTX能干擾DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成和胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞分裂,使胎盤、絨毛變性壞死、胚胎死亡，既往研究[7]認(rèn)為甲氨蝶呤或中藥加味宮外孕Ⅱ號(hào)方均具有殺胚作用，但兩者合用殺胚效果更好[8]。屈云飛等[9]用MTX治療異位妊娠，肝毒性發(fā)生率為6.81%。從本研究結(jié)果看，滋養(yǎng)葉細(xì)胞的變化及血β-HCG下降在中西醫(yī)結(jié)合組及中藥高劑量組更明顯，提示當(dāng)中藥劑量加大時(shí)殺胚作用增強(qiáng)，且能達(dá)到與中西藥結(jié)合組相似的效果。多年來(lái)，甲氨蝶呤廣泛用于治療異位妊娠，但治療后是否會(huì)增加下次妊娠胚胎的畸形或造成不良妊娠結(jié)局也是值得臨床醫(yī)師關(guān)注的問(wèn)題。孫聞嘉等[10]研究發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤應(yīng)用后廣泛分布于母體組織，在肝臟可持續(xù)蓄積達(dá)4個(gè)月之久，因此，在計(jì)劃妊娠前應(yīng)停止使用甲氨蝶呤≥4 個(gè)月。本研究也發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤和中藥雖可造成孕鼠肝細(xì)胞水腫，脂肪空泡分布，匯管區(qū)、小葉中央靜脈和間質(zhì)見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維結(jié)締組織增生；而中藥影響較輕。綜上所述，加味宮外孕Ⅱ號(hào)方可使孕鼠滋養(yǎng)葉細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，β-HCG分泌減少，妊娠不能維持，加之局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致胚胎組織發(fā)育停止并消亡。且隨劑量增加作用逐漸增強(qiáng)，但對(duì)肝臟的損害較西藥小。因此，在今后臨床中，對(duì)異位妊娠藥物保守治療的患者，為避免常規(guī)用甲氨蝶呤的副作用，我們是否可以首選中藥治療，并適當(dāng)增加中藥的劑量。由于本研究所用模型為宮內(nèi)妊娠的大鼠，結(jié)果存在一定的局限性，還需臨床大樣本、前瞻性、隨機(jī)隊(duì)列的進(jìn)一步研究。

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讀者·作者·編者

醫(yī)學(xué)出版物中有效數(shù)字的確定

有效數(shù)字是指在實(shí)際測(cè)量中所能得到的有意義的數(shù)字。一個(gè)由有效數(shù)字構(gòu)成的數(shù)值，只有末位數(shù)是估計(jì)數(shù)字，其余各位數(shù)字都必須是準(zhǔn)確的。有效數(shù)字與測(cè)量?jī)x器的靈敏度有關(guān)。以天平稱重為例，如果天平的靈敏度為0.1 mg,那么稱重結(jié)果16.14 mg為準(zhǔn)確數(shù)字，0.04 mg為估計(jì)數(shù)字，兩項(xiàng)合在一起組成有效數(shù)字。平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的位數(shù)，除了取決于測(cè)量?jī)x器的精密度外，還取決于樣本內(nèi)個(gè)體的變異，一般按標(biāo)準(zhǔn)差的三分之一來(lái)確定。如：(4.61±0.42)kg，標(biāo)準(zhǔn)差的三分之一為0.14，標(biāo)準(zhǔn)差波動(dòng)在百克位，即小數(shù)點(diǎn)后第1位上，故應(yīng)取到小數(shù)點(diǎn)后第一位，即(3.6±0.4)，過(guò)多的位數(shù)并無(wú)意義。但是在一系列數(shù)值并列時(shí)，小數(shù)點(diǎn)后的位數(shù)應(yīng)一致。如在(3.61±0.42)、(5.86±0.73)、(2.34±0.15)這樣一組數(shù)據(jù)中，第3組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差0.15的三分之一為0.05，在小數(shù)點(diǎn)后第2位，則該組數(shù)據(jù)的有效位數(shù)可均取到第2位。

貴州醫(yī)藥雜志社

Influence of trophoblast and liver of pregnancy rats with Chinese medicine which called the modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy.

ZhengWenlan1,YangJiangyan2,WenXiaomin1,ChenHuanhuan1.

1.TheFirstAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550001，Guizhou,China. 2.SuiyangCountyHospital,Suiyang563300,Guizhou,China.

Objective To observe the influence of trophoblast cell and liver of pregnancy rats with the modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy. Methods The building successful pregnancy rats were randomly divided into the western medicine group (treat by methotrexate), the Chinese medicine group(The modified decoction Ⅱ for ectopic pregnancy low, medium, high dose), the combination of Chinese and western medicine group (treat by methotrexate and Party), and the blank group (saline).These groups were given an intramuscular injection with MTX, Party or saline was gavage once a day, for 7 days. On the eighth day of drug delivery, the rats were killed and taken the femoral arterial blood, livers, gravid uterus and gestational sacs, and measured the value of blood β-HCG, then observed the pathology change of trophoblast cells and liver tissue. Results Compared with the blank group, the other five treatment groups of trophoblast cells structure were damaged to varying degrees, mitochondria swelling, nucleus heterochromatin increased, inflammatory cells infiltration, the structure of embryo abnormalities and reduced blood β-HCG value. The changes in TCM high dose group and the combination of Chinese and western medicine group were more apparent. There were differences in comparison with the other three treatment groups(P<0.05). And there were differences in comparison with the TCM medium dose group and the low dose group. In addition to TCM low dose group, the other groups of pregnant rats liver pathology score rise, there were statistical significantly differences compared with the blank group. The score of western medicine group and the combination of Chinese and western medicine group increased significantly, which were differences compared with the TCM high and medium dose group.Conclusion Modified decoction Ⅱ for ectopic pregnancy destructed trophoblast morphological structure, reducing the amount of sertoli cell, normal physiological function damaged and achieve the goal of killing embryos. There is concentration-response relationship, dose, the higher the better, killing the embryos stronger, and traditional Chinese medicine (TCM)on pregnance rat liver damage is lighter than methotrexate.

The modified decoction Ⅱfor ectopic pregnancy； Pregnancy rats；Trophoblast; Liver damage

貴州省科技廳聯(lián)合基金[黔科合中藥字(2011)LKZ7041]

R714.22

A

1000-744X(2016)10-1032-04

2016-05-30)