鞠延玲 朱國偉 趙旭 臧雪蓮

(錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

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·論 著·

miR-330-5p負(fù)性調(diào)控ADAM17基因抑制人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化

鞠延玲 朱國偉 趙旭 臧雪蓮

(錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

目的 探討人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HCMEC)間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)過程中 miR-330-5p和ADAM17基因的表達(dá)，闡明miR-330-5p對EndMT的影響。方法培養(yǎng)HCMEC，應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)后，利用免疫熒光化學(xué)檢測CD31和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在細(xì)胞中的表達(dá)。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對miR-330-5p和ADAM17基因的配對關(guān)系進(jìn)行預(yù)測。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR-330-5p模擬物后，Real-time PCR檢測miR-330-5p、ADAM17和α-SMA mRNA的表達(dá)，Western blotting檢測ADAM17和α-SMA 蛋白的表達(dá)。結(jié)果光鏡下可見誘導(dǎo)后細(xì)胞由鵝卵石形態(tài)變?yōu)殚L梭形，免疫熒光化學(xué)顯示誘導(dǎo)前有強(qiáng)烈的CD31表達(dá)，誘導(dǎo)后出現(xiàn)α-SMA的高表達(dá)。生物信息學(xué)軟件TargetScan和miRanYda顯示miR-330-5p和ADAM17基因二者靶向配對良好。Real-time PCR和Western blotting檢測結(jié)果均表明過表達(dá)miR-330-5p能夠降低ADAM17和α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)論miR-330-5p通過下調(diào)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADAM17基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT。

微小RNA； 解整合素-金屬蛋白酶17； 內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞

解整合素—金屬蛋白酶17(ADAM 17)是ADAMs家族成員，參與多種纖維增生型疾病[1-2]，而血管內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EndMT)是組織纖維化的重要途徑之一[3-5]，因此，推測ADAM 17可能作用于EndMT過程參與組織纖維化。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA，通過與靶基因mRNA 3’ 端非翻譯區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)，降解目的基因并下調(diào)其表達(dá)[6]，以此參與疾病發(fā)生過程中基因表達(dá)的調(diào)控。

本研究培養(yǎng)人心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HCMEC)，應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)發(fā)生EndMT，利用免疫熒光化學(xué)檢測CD31和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)在細(xì)胞中的表達(dá)。運(yùn)用生物信息學(xué)方法對miR-330-5p和ADAM17基因的配對關(guān)系進(jìn)行預(yù)測。脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染miR-330-5p模擬物后，Real-time PCR檢測miR-330-5p、ADAM17和α-SMA mRNA的表達(dá)，Western blotting檢測ADAM17和α-SMA 蛋白的表達(dá)，以闡明miR-330-5p調(diào)控ADAM17基因?qū)ndMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

HCMEC購自美國ScienCell公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，重組人TGF-β1 購于美國R&D公司，RNAiso for small RNA、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex TaqTMⅡ和引物購自大連TaKaRa公司，兔抗人ADAM17、CD31和α-SMA抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 HCMEC培養(yǎng)并TGF-β1誘導(dǎo)

HCMEC接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，在孵箱中(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)，每3 d換1次液，細(xì)胞貼壁達(dá)80%左右，0.25% 胰酶消化細(xì)胞并傳代，向培養(yǎng)基中添加10 ng/mL TGF-β1，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EndMT。

1.3 細(xì)胞免疫熒光檢測

取適量細(xì)胞涂片，10%甲醛固定后應(yīng)用0.1%BSA封閉1 h，加兔抗人多克隆CD31和α-SMA抗體(1∶300)，室溫孵育1 h，PBS浸洗后，滴加二抗(1∶800)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。

1.4 生物信息學(xué)方法預(yù)測

運(yùn)用miRNA生物信息學(xué)軟件TargetScan (http://www.targetscan.org/)和miRanda (http://www.microrna.org/)分別對miR-330-5p和ADAM17(NM_003183)基因的靶向配對關(guān)系進(jìn)行預(yù)測。

1.5 細(xì)胞分組

普通常規(guī)培養(yǎng)HCMEC為空白對照組(control)；TGF-β1誘導(dǎo)HCMEC為陽性對照組(TGF-β1)；脂質(zhì)體 2000轉(zhuǎn)染miR-330-5p模擬物為轉(zhuǎn)染組(mimics)；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)應(yīng)用 TGF-β1誘導(dǎo)為mimics +TGF-β1組。

1.6 Real-time PCR

取上述4組細(xì)胞分別加入Trizol 或RNAiso for small RNA提取總mRNA或總miRNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，稀釋后加入SYBRPremix Ex Taq Ⅱ和引物，見表1，跑40 個(gè)循環(huán)的PCR 反應(yīng)，應(yīng)用軟件對反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1 引物序列

1.7 Western blotting

取上述4組細(xì)胞分別加入RIPA裂解液充分震蕩后，超聲破碎，4 ℃離心20 min，采用BCA法測定樣品總蛋白量。取15 μL 樣品SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用4% BSA封閉1 h，加入兔抗人多克隆ADAM17和α-SMA抗體(1∶300)，4 ℃過夜后，滴加二抗(1∶800)，4 ℃搖床1 h后凝膠成像系統(tǒng)ECL發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下可見誘導(dǎo)前(control)HCMEC均勻分布，呈鵝卵石形態(tài)；經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)伸長，呈長梭形，排列較松散。免疫熒光化學(xué)顯示誘導(dǎo)前細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)烈CD31蛋白表達(dá)，顯示紅色熒光；經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后出現(xiàn)α-SMA的表達(dá)，呈現(xiàn)綠色熒光，CD31蛋白仍有表達(dá)。見圖1。

圖1 誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

2.2 miR-330-5p和ADAM17的配對關(guān)系

分別運(yùn)用TargetScan和miRanda對miR-330-5p和ADAM17基因的靶向配對關(guān)系進(jìn)行預(yù)測，TargetScan顯示miR-330-5p在ADAM17 mRNA 3’UTR上有一個(gè)保守的靶位點(diǎn)，其類型為7mer-m8，匹配得分為92。miRanda結(jié)果表明miR-330-5p與靶位點(diǎn)的mirSVR 得分為-0.980 3，綜合兩個(gè)生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果可以看出miR-330-5p與ADAM17基因配對良好。見表2。

表2 miR-330-5p 與ADAM17基因配對關(guān)系

2.3 Real-time PCR檢測結(jié)果

應(yīng)用Real-time PCR對各組細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)如果將control組細(xì)胞miR-330-5p的表達(dá)量設(shè)定為1，則mimics組和TGF-β1組分別是control組的(30.77±7.62)和(0.23±0.06)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而mimics +TGF-β1組是control組的(12.47±4.06)倍，與TGF-β1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果將control組ADAM17的表達(dá)量設(shè)定為1，則mimics組和TGF-β1組分別是control組的(0.17±0.04)和(19.68±5.81)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而mimics +TGF-β1組是control組的(0.71±0.19)倍，與TGF-β1組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如果將control組α-SMA的表達(dá)量設(shè)定為1，則TGF-β1組是control組的(20.59±6.32)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。由此可見，miR-330-5p通過下調(diào)ADAM17基因表達(dá)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT過程。

圖2 基因在各組中的相對表達(dá)水平(*P<0.05,**P<0.05)

2.4 Western blotting檢測結(jié)果

應(yīng)用Western blotting對各組細(xì)胞進(jìn)行檢測，條帶結(jié)果顯示ADAM17蛋白表達(dá)量在mimics組最低，可見miR-330-5p的過表達(dá)能直接抑制ADAM17蛋白的生成，而在TGF-β1組最高，表明ADAM17參與TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT過程，且可作為間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度的標(biāo)志。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA蛋白在TGF-β1組最高，表明TGF-β1成功誘導(dǎo)HCMEC發(fā)生EndMT。隨著miR-330-5p轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，α-SMA表達(dá)量有所下降，表明miR-330-5p的過表達(dá)間接抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT。見圖3。這顯示了miR-330-5p通過負(fù)性調(diào)控ADAM17基因表達(dá)能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT。

圖3 ADAM17和α-SMA蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞是組織器官纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞[7-8]，而內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EndMT)是纖維化組織肌成纖維細(xì)胞的重要來源。Zeisberg 等[9]發(fā)現(xiàn)大約 30%活化的成纖維細(xì)胞是由內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)可抑制 TGF-β1 誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞EndMT過程，改善小鼠心肌纖維化程度。本研究發(fā)現(xiàn)采用TGF-β1能夠成功誘導(dǎo)HCMEC發(fā)生EndMT，倒置相差顯微鏡下可見誘導(dǎo)前HCMEC均勻分布，呈鵝卵石形態(tài)；經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)伸長，呈長梭形，排列較松散。免疫熒光化學(xué)顯示誘導(dǎo)前細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)烈CD31蛋白表達(dá)；經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后出現(xiàn)α-SMA的高表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)后有ADAM 17蛋白的高表達(dá)，提示其或可作為間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度的標(biāo)志。

MicroRNA作為非編碼RNA，其長度大約為21～25nt，與EndMT過程密切相關(guān)。Thum 等[10]發(fā)現(xiàn)在心肌纖維化模型小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中敲除 miR-21，能夠顯著減少α-SMA陽性細(xì)胞數(shù)，并能夠降低Ⅰ型膠原蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)。Kumarswamy 等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21能夠通過調(diào)控 PTEN/Akt 信號(hào)通路，參與EndMT過程。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法對miR-330-5p和ADAM17基因的靶向配對關(guān)系進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)二者匹配良好。應(yīng)用Real-time PCR對各組細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后內(nèi)源性miR-330-5p顯著降低而ADAM17蛋白顯著升高；通過對mimics組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)miR-330-5p模擬物轉(zhuǎn)染成功同時(shí)ADAM17蛋白低表達(dá)，以上均表明miR-330-5p能夠靶向作用于ADAM17 蛋白并抑制其表達(dá)。分析α-SMA在各組中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后其顯著升高，表明HCMEC發(fā)生EndMT；而轉(zhuǎn)染miR-330-5p模擬物后，無論誘導(dǎo)與否，其表達(dá)量與control組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-330-5p并不直接作用于α-SMA蛋白，但其過表達(dá)能夠抑制HCMEC的EndMT，Western blotting結(jié)果進(jìn)一步印證了以上結(jié)論。由此可見，miR-330-5p通過下調(diào)ADAM17基因表達(dá)能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EndMT過程。

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MiR-330-5p down-regulated ADAM17 expression in human cardiac microvascular endothelial cells and inhibited endothelial-to-mesenchymal transition

JuYanling,ZhuGuowei,ZhaoXu,ZangXuelian.

JinzhouCentralHospital,Jinzhou121001,Liaoning,China.

Objective To identify expressions of miR-330-5p and ADAM17 in human cardiac microvascular endothelial cells (HCMEC) and explore the role of miR-330-5p on endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) which may regulate ADAM17 expression. Methods HCMEC were purchased and then cultured in vitro. Cell morphology was observed with phase contrast microscope and expressions of CD31 and α-SMA in HCMEC were determined by immunofluorescence cytochemistry. MiR-330-5p which may regulate ADAM17 expression was predicted by bioinformatics. After transfection of miR-330-5p mimics into cells, the expressions of miR-330-5p, ADAM17 and α-SMA were determined by real-time PCR and western blotting (WB). Results Before the induction of TGF-β1 in HCMEC, CD31 expression was positive. However, α-SMA was found after the induction by immunofluorescence cytochemistry. Real-time PCR and western blotting was showed over-expression of miR-330-5p down-regulated ADAM17 and α-SMA expressions. Conclusion MiR-330-5p down-regulated ADAM17 expression in HCMEC and then inhibit EndMT.

miRNA； ADAM17； EndMT； HCMEC

R331.3

A

1000-744X(2016)10-1011-04

2016-06-10)