喬曉芳， 王春艷， 顧寶華 ， 田慶南1,

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001; 2.安陽市城鄉(xiāng)一體化示范區(qū)食品藥品監(jiān)督管理中心 河南 安陽 455000； 3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

?

無糖基化修飾GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表達(dá)、純化

喬曉芳1,2， 王春艷3， 顧寶華3， 田慶南1,3

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001; 2.安陽市城鄉(xiāng)一體化示范區(qū)食品藥品監(jiān)督管理中心 河南 安陽 455000； 3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001)

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一種腸促胰島素激素，具有很好的綜合降糖效果，但其在血漿中的半衰期只有短暫幾分鐘,限制了GLP-1在臨床方面的應(yīng)用.為延長(zhǎng)GLP-1的半衰期，合成了GLP-1-Fc融合基因，將N-糖基化作用的受體天冬酰胺突變?yōu)楸彼?，?gòu)建了無糖基化修飾的GLP-1-Fc(N126A)融合表達(dá)載體，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白，并利用rProteinA獲得了高純度融合蛋白.

胰高血糖素樣肽-1； Fc融合蛋白； 酵母表達(dá)

0 引言

胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptid-1, GLP-1)是由直腸、結(jié)腸和遠(yuǎn)端回腸的L細(xì)胞分泌、由前胰升血糖素衍生的一種多肽激素[1].GLP-1的腸促胰島素作用依賴于血漿中的葡萄糖濃度，在高血糖的情況下，可促進(jìn)胰島素的分泌.因此，GLP-1在II 型糖尿病的治療中具有重要的價(jià)值[2].但是，GLP-1在血漿中極易被降解，半衰期較短，僅有3～5 min[3-4]，嚴(yán)重限制了GLP-1在臨床方面的應(yīng)用.因此，利用基因工程的方法構(gòu)建能延長(zhǎng)GLP-1半衰期的GLP-1類似物是解決這一問題的良好方法.本研究將GLP-1與Fc片段融合，以延長(zhǎng)GLP-1的半衰期[5-6].

目前，人們常用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng).酵母菌表達(dá)系統(tǒng)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，具備了原核生物快速繁殖、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)，同時(shí)能夠分泌表達(dá)，完成蛋白質(zhì)修飾[7-8].但是，在酵母表達(dá)修飾系統(tǒng)中，糖基化修飾能引起免疫原性，降低半衰期，因此如何利用酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得無糖基化的融合蛋白是進(jìn)一步優(yōu)化GLP-1表達(dá)的難點(diǎn).

本研究通過構(gòu)建GLP-Fc融合表達(dá)載體，利用畢赤酵母GS115表達(dá)系統(tǒng)，獲得了GLP-Fc融合表達(dá)蛋白，并通過突變N-糖基化位點(diǎn)N126,進(jìn)一步獲得無糖基化修飾融合蛋白，為獲得半衰期長(zhǎng)、免疫原性低、生產(chǎn)成本低的GLP-1融合蛋白提供了一種有效途徑.

1 材料與方法

1.1 材料

菌株:PPIC3.5k質(zhì)粒、大腸桿菌XL-10、畢赤酵母GS115、GS115-DT-6，均由本實(shí)驗(yàn)室提供和保存.

1.2 試劑

rTaq酶、25 mmol/L dNTPs、T4 DNA連接酶、DL2000DNA分子量marker、DL5000DNA分子量marker；限制性內(nèi)切酶(NotI、BamHI)為NEB公司產(chǎn)品；pfuDNA聚合酶購(gòu)自上海生工公司；GoldView TM核酸染料購(gòu)自Biorule；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司；無縫克隆試劑盒購(gòu)自上海近岸科技有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建 GLP-1-Fc基因由上海生工生物工程有限公司合成，在基因的5’端添加XhoI的酶切位點(diǎn)，3’端添加TAA終止密碼子和NotI酶切位點(diǎn).利用重疊延伸PCR，構(gòu)建aF-GLP-1-Fc基因片段.分別利用BamHI-HF和NotI-HF雙酶切pPIC3.5k質(zhì)粒及目的基因，并進(jìn)行純化回收.經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-10，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，抽提質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序.

1.3.2 GLP-1-Fc(N126A)的構(gòu)建 突變體表達(dá)載體構(gòu)建主要采用QuikChange 定點(diǎn)突變技術(shù).以Ala的密碼子序列為中心、設(shè)計(jì)上下游引物.對(duì)合成引物進(jìn)行磷酸化，利用磷酸化后引物進(jìn)行QuikChange PCR，經(jīng)DpnI 酶切后轉(zhuǎn)化XL-10.挑選菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，并提取質(zhì)粒進(jìn)行序列分析.

1.3.3 GLP-1-Fc(N126A)的表達(dá)SaCI單酶切重組質(zhì)粒pPIC3.5k-aF-GLP-1-Fc，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化.利用乙醇沉淀法純化線性化后的質(zhì)粒.通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，挑取陽性菌落接種于BMGY培養(yǎng)液中220 rpm、29 ℃培養(yǎng)約24 h.24 h培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至其終濃度為0.5%，開始蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).加入濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)6 d.取樣的菌液按照12 000 rpm離心10 mim后,將上清和沉淀分開，保存至-20 ℃冰箱中.

1.3.4 GLP-1-Fc(N126A)的分離純化 HiTrap rProtein A FF預(yù)裝柱及KTAprimeTMPLUS蛋白純化系統(tǒng)對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析.結(jié)合緩沖液采用20 mmol/L磷酸鈉(pH 7.0)緩沖液，洗脫液采用0.1 mol/L檸檬酸鈉(pH 3.0)緩沖液.

1.3.5 Western blot檢測(cè)目的蛋白 將純化獲得的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，待電泳結(jié)束后，取出凝膠，參照蛋白marker，切下目的蛋白應(yīng)在部分，做好標(biāo)記后放在1×電轉(zhuǎn)液中浸泡5 min.經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，按1∶8 000用封閉液稀釋羊抗人IgG Fc(HRP)抗體，將NC膜轉(zhuǎn)入其中，放在脫色搖床上室溫孵育2 h.將NC膜取出洗膜30 min后，在暗室內(nèi)，按照ECL試劑盒說明書取A液與B液各1 mL在EP管中充分混勻后，均勻加到NC膜上，孵育1.5 min，曝光并保存圖片.

2 結(jié)果

2.1 aF-GLP-1-Fc表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定

提取含有已經(jīng)優(yōu)化過的信號(hào)肽的酵母基因組，PCR獲得信號(hào)肽aF，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化的DNA片段大小為288 bp；目的基因GLP-1-Fc由生工生物公司合成，基因大小為914 bp.通過重疊延伸PCR的方法構(gòu)建目的基因aF- GLP-1-Fc，片段大小為1 202 bp.利用BamHI-HF和NotI-HF雙酶切pPIC3.5k質(zhì)粒及目的基因片段，并通過T4連接酶將目的基因連入表達(dá)載體.重組質(zhì)粒利用BamHI-HF和NotI-HF雙酶切鑒定(如圖1)，大小正確，同時(shí)，DNA測(cè)序結(jié)果分析讀碼框正確、未發(fā)生移碼.

2.2 GLP-1-Fc(N126A)的構(gòu)建

N-糖基化的第一步是將14C的核心寡聚糖添加到新形成的多肽鏈的天冬酰胺受體上，其特征氨基酸的序列為Asn-X-Ser/Thr.通過分析GLP-1-Fc序列，第126位天冬氨酸為融合蛋白N-糖基化位點(diǎn).因此，本研究為獲取無糖基化修飾蛋白，構(gòu)建了GLP-1-Fc(N126A)突變體(如圖2).突變體構(gòu)建采用QuikChange 定點(diǎn)突變技術(shù)，引物磷酸化后，通過QuikChange PCR，轉(zhuǎn)化XL-10，經(jīng)酶切驗(yàn)證、測(cè)序分析后挑取陽性克隆進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)、蛋白純化.

M：DL5000；1～2：提取的陽性質(zhì)粒

圖1 af-GLP-1-Fc重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
Fig.1 The double digests analysis of af-GLP-1-Fc construction

A：QuikChange PCR；B：aF-GLP-1-Fc與aF-GLP-1-Fc(N126A)序列比對(duì)

2.3 GLP-1-Fc(N126A)的誘導(dǎo)表達(dá)

將含有GLP-1-Fc(N126A)表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化畢赤酵母.以BMGY作為培養(yǎng)液經(jīng)甲醇誘導(dǎo)6天后取上清，SDS-PAGE檢測(cè)，30～40 kD處含有誘導(dǎo)蛋白表達(dá)條帶(如圖3).為了進(jìn)一步確認(rèn)融合蛋白的表達(dá)，利用抗Fc抗體對(duì)上清液進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，ECL顯色進(jìn)一步確認(rèn)表達(dá)蛋白中含有Fc片段(如圖4).

圖3 SDS-PAGE電泳檢測(cè)GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis the expression of GLP-1-Fc(N126A) fusion protein

圖4 Western blot檢測(cè)GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of the GLP-1-Fc(N126A) fusion protein expression

2.4 GLP-1-Fc(N126A)的表達(dá)和純化

rProtein A親和層析柱能夠特異結(jié)合Fc片段蛋白，如圖5所示，利用rProtein A親和層析柱進(jìn)行一次純化即可獲得單一的洗脫峰(473.5 mL).將洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白純度為80%(如圖6).

圖5 rProtein A親和層析純化GLP-1-Fc(N126A)融合蛋白色譜圖 Fig.5 Affinity chromatography of GLP-1-Fc(N126A)with rProtin A

圖6 SDS-PAGE檢測(cè)GLP-1-Fc(N126A)的純化結(jié)果Fig.6 SDS-PAGE analysis the expression of GLP-1-Fc(N126A) fusion protein

3 討論

近幾年，II型糖尿病發(fā)病率急劇提高，醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域越來越關(guān)注II型糖尿病的治療，使其成為科研工作者研究的熱點(diǎn)問題.GLP-1具有促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素合成、減退食欲、減少食物吸收等作用，在降血糖的同時(shí)還可以降低體重、副作用不明顯，所以其在治療II型糖尿病方面存在巨大潛力[9-11].

本研究將GLP-1與人的Ig4蛋白基因進(jìn)行融合，并構(gòu)建酵母表達(dá)載體(如圖1所示)，通過增加融合蛋白的分子量，降低腎臟清除融合蛋白的速率，并利用Fc的循環(huán)受體(ecycling receptors，F(xiàn)cRn)使得重組蛋白能循環(huán)利用，進(jìn)一步延長(zhǎng)重組蛋白在血漿中的作用，從而延長(zhǎng)融合蛋白的半衰期.美國(guó)FDA已經(jīng)批準(zhǔn)上市的融合蛋白GLP-1-Fc采用細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)成本高，本研究選擇易于大規(guī)模培養(yǎng)、能夠進(jìn)行分泌表達(dá)的畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)，首先從發(fā)酵條件上極大程度減少了生產(chǎn)成本.此外，酵母表達(dá)系統(tǒng)存在糖基化修飾，容易表達(dá)糖蛋白進(jìn)而縮短半衰期、增加免疫原性[12-13]，通過對(duì)融合蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，GLP-1-Fc僅存在N126一個(gè)N-糖基化位點(diǎn).為減少糖基化修飾的影響，本研究進(jìn)一步將N126位點(diǎn)天冬氨酸成突變?yōu)榱吮彼?如圖2所示)，通過改變N-糖基化的特征序列避免N-糖基化的形成，進(jìn)一步減少了免疫原性.融合蛋白在酵母中經(jīng)甲醇誘導(dǎo)6天后在發(fā)酵上清中存在顯著過表達(dá)條帶(如圖3所示)，表明融合蛋白胞外表達(dá)成功，簡(jiǎn)化了胞內(nèi)表達(dá)蛋白純化所需步驟.發(fā)酵上清在液相色譜經(jīng)ProteinA純化中僅出現(xiàn)單一峰，僅經(jīng)一步純化即可獲得高純度產(chǎn)物(如圖5、6)，所需純化工藝簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化生產(chǎn).綜上所述，本研究從表達(dá)和純化兩方面減少了GLP-1-Fc生產(chǎn)成本，為國(guó)內(nèi)GLP-1的新藥研發(fā)打下了基礎(chǔ).

[1] WASADA T. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1)[J]. Nippon Rinsho, 2004,62(6):1175-1180.

[2] CHAVANIEU A. Structural requirements of the N-terminal region of GLP-1-(7-37)-NH2 for receptor interaction and cAMP production[J].European journal of medicinal chemistry, 2004,39(6), 473-480.

[3] ROLIN B. The major glucagon-like peptide-1 metabolite, GLP-l-(9-36)-amide, does not affect glucose or insulin levels in mice[J]. Eur Pharmacol, 2004,494(2/3):283-288.

[4] HOLST J. Treatment of type II diabetes mellitus with agonists of the GLP-1 receptor or DPP-IV inhibitors[J]. Expert opinion on emerging drugs,2004,9(1):155-166.

[5] 王圣鈞, 郁慧麗, 翟琳, 等.人GLP-l-IgG Fc融合蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J]. 生物技術(shù), 2011,21(4):29-33.

[6] AZIZ A. Exendin-4, a GLP-1 receptor agonist, interacts with proteins and their products of digestion to suppress food intake in rats[J]. Journal of nutrition, 2003,133(7):2326-2330.

[7] OZES O, KLEIN S. A comparison of interferon Con1 with natural recombinant interferons-alpha: anti-viral anti-proliferative and natural killer-inducing activities[J]. Interferon Res, 1992,12(1):55-59.

[8] KOYAMA A, ADACHI A. Comparison of an antiviral activity of recombinant consensus interferon with recombinant interferon-alpha-2b[J]. Microbes infect, 1999,13(1):1071-1073.

[9] KJELLIS L. The influence of GLP-1 on glucose stimulated insulin secretion: effects on β-cell sensitivity in type II and nondiabetic subjects[J]. Diabetes, 2003, 52(2):380-386.

[10] ALESSIO D. Glucagon-like peptide-1: evolution of an incretin into a treatment for diabetes[J]. Physiol Endocrinnol Metab, 2004,286(6):882-890.

[11] MEIER J. Intravenous glucagon-like peptide 1 normalizes bloodglucose after major surgery in patients with type II diabetes [J]. Crit Care Med, 2004,32(3):848-851.

[12] NOFFZ S. Hetero-oligomeric interactions between early glycosyltransferases of the dolichol cycle[J]. Glycobiology, 2009, 19(5):472-478.

[13] LU J, TAKAHASHI T, OHOKA A, et al. Alg14 organizes the formation of a multiglycosyltransferase complex involved in initiation of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis[J]. Glycobiology, 2012, 22(4):504-516.

(責(zé)任編輯：王浩毅)

Expression and Purification of Non-glycosylated Glp-1-Fc(N126A)
Fusion Protein in Yeast Expression System

QIAO Xiaofang1,2， WANG Chunyan3, GU Baohua3， TIAN Qingnan1,3

(1.DepartmentofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China; 2.CenterofAnyangHigh-
TechZoneFoodandDrugAdministration,Anyang455000,China; 3.SchoolofLifeScience,Zhengzhou
University,Zhengzhou450001,China)

Glucagon-like peptide-1(GLP-1) is a kind of ducdenin, which has good and comprehensive hypoglycemic effect.The GLP-1 was easy to be degraded in plasma. To prolong the half-life of GLP-1, the GLP-1-Fc(N126A) was constructed through mutant N-glycosylation asparagine receptor into alanine. The GLP-1-Fc(N126A) fusion protein was obtained by yest expression system, and was purified by rProteinA.

glucagon-like peptide-1(GLP-1); Fc fusion protein; yeast expression

2016-09-27

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31601867)；中國(guó)博士后基金特別資助項(xiàng)目(2016T90674)．

喬曉芳(1977—)，女，河南安陽人，主管藥師，主要從事生物醫(yī)藥研究，E-mail:ayqiaoxiaofang@163.com；通訊作者：田慶南(1986—)，男，河南商丘人，講師，主要從事生物醫(yī)藥研究，E-mail:tqn127@163.com．

喬曉芳，顧寶華，田慶南.無糖基化修飾GLP-1-Fc(N126A)在酵母中的表達(dá)、純化[J] ．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版)，2016，48(4)：86-89．

Q784;Q786;Q789

A

1671-6841(2016)04-0086-04

10.13705/j.issn.1671-6841.2016697