王 瑩， 呂心瑞

(河南大學 1第一附屬醫(yī)院， 2醫(yī)學院生理教研室， 河南 開封 475004)

Am80抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和血管新生內(nèi)膜形成的機制研究*

王 瑩1， 呂心瑞2△

(河南大學1第一附屬醫(yī)院，2醫(yī)學院生理教研室， 河南 開封 475004)

目的： 探討維甲酸衍生物Am80抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和大鼠頸總動脈內(nèi)皮剝脫術后新生內(nèi)膜增生的機制。方法:用不同濃度Am80處理EA-hy926細胞24 h后，應用細胞計數(shù)和MTS細胞活力分析檢測細胞的增殖情況；將Am80處理的細胞進行PI染色，用流式細胞術檢測細胞周期的變化情況；通過real-time PCR方法分析Am80處理后EA-hy926細胞中cyclinB1、P21和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達的變化；制備SD大鼠頸總動脈內(nèi)皮球囊損傷模型，通過HE和免疫組化染色方法，觀察Am80對球囊損傷后新生內(nèi)膜形成的影響。結(jié)果:細胞計數(shù)和MTS細胞活力分析結(jié)果顯示，Am80以濃度依賴性方式抑制EA-hy926血管內(nèi)皮細胞增殖；流式細胞分析顯示，Am80可使EA-hy926細胞周期停滯在G2/S期；real-time PCR結(jié)果表明，Am80處理后，EA-hy926細胞中P21表達上調(diào)，cyclinB1和MMP-2表達水平降低；內(nèi)皮損傷動物模型結(jié)果顯示，Am80處理后新生內(nèi)膜的形成受到顯著抑制。結(jié)論:Am80可通過促進P21而抑制cyclinB1表達，從而抑制血管內(nèi)皮細胞增殖和血管新生內(nèi)膜的形成。

Am80; 血管內(nèi)皮細胞； 內(nèi)膜增生； 細胞周期

血管內(nèi)膜損傷是動脈粥樣硬化、血管術后再狹窄等心血管疾病的主要病理因素。血管內(nèi)皮細胞異常增殖常常發(fā)生在血管損傷之后，內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力的增強，常常又是引起高血壓等血管增殖性疾病的主要病理基礎。所以抑制血管內(nèi)膜異常增生是預防和扭轉(zhuǎn)心血管疾病的根本措施之一。Am80是一種人工合成的維甲酸衍生物，是維甲酸受體α的激動劑，已經(jīng)在臨床上用于治療急性早幼粒細胞性白血病[1]。新的研究證明，Am80也可以通過激活其它的分子通路，促進其抗增殖、促分化的生物功能[2-4]。在心血管組織中，Am80能誘導血管平滑肌細胞分化并抑制其增殖和遷移，有效抑制大鼠動脈粥樣硬化模型中血管內(nèi)膜的增生[5-7]。在前期研究中，我們已經(jīng)揭示了Am80可以通過提高核轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)的表達水平，抑制血管平滑肌的遷移和異常增生[8]。但對于Am80如何抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，通過什么通路抑制內(nèi)皮細胞增殖的則知之甚少。本研究主要通過Am80對內(nèi)皮細胞增殖及對大鼠頸總動脈球囊損傷模型中內(nèi)膜增生的研究，揭示了Am80在抗細胞增殖和周期蛋白的調(diào)控上抑制血管內(nèi)膜增殖的分子機制。

材 料 和 方 法

1 細胞株和試劑

兔抗cyclinB1和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2多克隆抗體購自Abcam；Am80和Tween-80購自Sigma；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Beckman；MTS試劑盒購自Promega；引物合成來自上海生工；羊抗兔II抗和DAB試劑盒購自北京中杉金橋；人臍靜脈內(nèi)皮細胞株EA-hy926購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 細胞貼壁生長于細胞瓶中，用含10%胎牛血清及1×105U/L青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞計數(shù) 細胞接種于96孔板，每孔加入100 μL，細胞濃度為2×107/L，于37 ℃、5% CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入不同濃度的Am80培養(yǎng)24 h。取10 μL細胞懸液與0.2%臺盼藍溶液混合染色至計數(shù)板上計數(shù)。

2.3 MTS實驗檢測細胞活力 采用CellTiter 96? AQueous 單溶液細胞活力試劑盒(Promega)，按說明書流程操作，用細胞計數(shù)儀調(diào)整細胞濃度為為2×107/L，在 96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，每組設6個復孔，培養(yǎng)一段時間后，每孔加入20 μL MTS試劑于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，終止反應，應用全自動多功能酶標儀檢測其490 nm波長處的吸光度(A)值。

2.4 流式細胞術分析細胞周期 取對數(shù)生長期EA-hy926細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度Am80作用于細胞24 h，收集各孔細胞及上清，離心棄上清，用冷PBS洗2次，調(diào)整各孔細胞數(shù)量為1×106，加入預冷的70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜。離心收集細胞，PBS洗過后，加入含50 mg/L PI、100 mg/L RNaseA、0.2% Triton X-100工作液500 μL，孵育15 min后用流式細胞儀檢測。重復3次。

2.5 Real-time PCR實驗 采用TRIzol總RNA提取試劑(Invitrogen)提取細胞總RNA，以Oligo(dT)18為引物，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(Promega)操作進行反轉(zhuǎn)錄。得到的cDNA按SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR檢測。 P21的上游引物序列為5’-CTTCATCTCTCGGTCCCTTC-3’，下游引物序列為5’-CGGGTTACTCCTTCTGTTGT-3’；cyclinB1的上游引物序列為5’-AGGGCTGCCACGGACCGAGT-3’，下游引物序列為5’-CTGGCACCGGGAGGGCACTT-3’；MMP-2的上游引物序列為5’-AGACCCCGGAGGCTAAGGAGTT-3’，下游引物序列為5’-TCCGTCATAGTGTCCTCCATCA-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGCCCAGAACATCATCCCT-3’，下游引物序列為5’-GCCTCTCTCTTGCTCTCAGTA-3’。每個PCR反應體系包括為2 μL稀釋的RT產(chǎn)物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix以及250 nmol/L上、下游引物，總反應體積為20 μL，經(jīng)ABI 7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測，反應循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，共40個循環(huán)。基因的表達變化用2-ΔΔCt法計算，以GAPDH mRNA的水平作為內(nèi)參照。

2.6 頸總動脈內(nèi)皮損傷動物模型的復制 參照之前的手術方法[5]，實驗動物用25%烏拉坦 (3 mL/kg) 腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，從頸外動脈遠心端結(jié)扎，將頸內(nèi)動脈和頸總動脈近心端用血管夾關閉血流，于頸外動脈遠心端扎線部位的內(nèi)側(cè)剪一楔形切口，球囊導管自切口處向近心端插入，打開血管夾，導管穿過頸總動脈至主動脈分支處。注入約100 μL生理鹽水充盈球囊，然后將球囊拖回到切口處，其間以導絲為軸線旋轉(zhuǎn)球囊。如此反復3次，退出球囊，關閉切口，恢復血流。體重 250～300 g的雄性SD大鼠隨機分為3組，分別為假手術(sham)組、損傷(injured)組、Am80組。Am80組大鼠于術前1 d至術后28 d進行1 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，其它組大鼠以同樣方式給予相同劑量的Tween-80，實驗期間給予普通飼料飲食，自由進食進水，于術后28 d從股動脈放血處死動物，迅速分離左側(cè)頸總動脈和對側(cè)血管用于后續(xù)實驗。

2.7 血管HE染色觀察 切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色5 min；自來水沖洗返藍5 min，1% 鹽酸乙醇稍分化數(shù)秒，自來水沖洗5 min；伊紅染色10 s；常規(guī)梯度乙醇脫水，即依次放入70%、80%、90%、95%的乙醇3 s 和無水乙醇中3 min、3次，二甲苯透明3 min、3次；中性樹膠封片；鏡下觀察、照相，進行圖像學分析。

2.8 血管免疫組化觀察 切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復后，滴加3% H2O2去離子水，室溫孵育10 min；消除內(nèi)源性過氧化物酶影響，滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min進行封閉；傾去血清，滴加兔抗cyclinB1多克隆抗體(1∶100)；片子平放保濕盒中4 ℃過夜后，滴加生物素化 II 抗工作液，室溫孵育15 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15 min；滴加DAB試劑顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水沖洗終止反應；蘇木精復染細胞核；常規(guī)脫水、透明、封片；鏡下觀察、照相，進行圖像學分析。

2.9 血管組織總蛋白的提取 分離大鼠頸總動脈，于冷PBS中洗凈血液，去除血管外結(jié)締組織，將血管剪碎后置勻漿套管中，100 mg 組織加入1 mL RIPA裂解液，冰浴勻漿。勻漿后靜置30 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清 (即蛋白提取液)，分裝儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?以牛血清白蛋白為標準品，用改 良的Lowry 法進行蛋白定量。

2.10 Western blot分析 灌制 8%分離膠和5%濃縮膠。用微量加樣器將樣品加入到凝膠加樣孔內(nèi)。 90 V穩(wěn)壓電泳約30 min，待溴酚藍進入分離膠后，換用120 V 穩(wěn)壓電泳，至溴酚藍前緣移動到距凝膠底部0.5 mm，停止電泳，取出凝膠，進行半干轉(zhuǎn)膜，然后取出PVDF膜，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉 2 h。 將封閉后的PVDF膜置入用TBST以適當比例稀釋的I抗溶液中，4 ℃緩慢搖動過夜。室溫洗膜，然后將PVDF膜置入用TBST 1∶20 000稀釋RDye～800CW 熒光標記II抗溶液中，于室溫反應1 h, 室溫洗膜后用Odyssey發(fā)光。

3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。均數(shù)先進行單因素方差分析，然后用Bonferroni校正的t檢驗行各組均數(shù)間兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Am80抑制血管內(nèi)皮細胞增殖

細胞計數(shù)實驗顯示，Am80不同濃度刺激EA-hy926細胞24 h后，細胞數(shù)量隨濃度增加逐漸減少；而且MTT分析結(jié)果也顯示，Am80刺激EA-hy926細胞后，細胞活力隨濃度逐漸下降，這一結(jié)果與細胞周期數(shù)據(jù)分析具有一致性，見圖1。

Figure 1.Am80 inhibited the proliferation of EA-hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖1 Am80 抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖

2 Am80阻滯血管內(nèi)皮細胞周期進程和抑制周期蛋白的表達

用不同濃度的Am80刺激血管內(nèi)皮細胞24 h后發(fā)現(xiàn)，Am80可使內(nèi)皮細胞周期停滯在G2/S期(P<0.05)，說明Am80可誘導細胞周期阻滯。為了探討 Am80 誘導細胞周期阻滯的作用機制，我們選用不同濃度Am80刺激EA-hy926細胞24 h和濃度為4 μmol/L的Am80刺激EA-hy926細胞不同時點后，提取細胞總RNA，通過real-time PCR方法檢測細胞周期抑制蛋白 P21和細胞周期蛋白cyclinB1以及MMP-2 mRNA的表達變化。結(jié)果顯示，在Am80 濃度為 0～4 μmol/L范圍內(nèi)，P21 的mRNA表達水平呈劑量依賴性升高，而cyclinB1和MMP-2的mRNA表達水平呈劑量依賴性降低；P21的mRNA表達水平呈時間依賴性升高，而cyclinB1和MMP-2的mRNA表達水平呈時間依賴性降低。見圖2。

3 Am80顯著抑制血管新生內(nèi)膜增生

大鼠球囊內(nèi)皮剝脫后28 d的損傷組頸總動脈中的內(nèi)膜明顯增生，呈彌散性增厚，管腔變小，內(nèi)膜與中膜的厚度比值(I/M比值)，明顯高于對照組；Am80組新生內(nèi)膜的增生程度和 I/M 比值明顯小于模型組(P<0.05)。以上結(jié)果顯示，Am80 可以明顯抑制球囊損傷誘導的血管內(nèi)增生，見圖3。

Figure 2.The effects of Am80 on the cell cycles and the mRNA expression of P21, cyclinB1 and MMP-2 in EA-hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs0 h.

圖2 Am80 阻滯血管內(nèi)皮細胞細胞周期進程和抑制周期蛋白mRNA的表達

Figure 3.Inhibitory effects of Am80 on intimal hyperplasia of carotid arteries after balloon injury. I/M： intima/tunicae media. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsinjuried group.

圖3 Am80 抑制球囊損傷誘導的血管內(nèi)膜增生

4 Am80抑制血管內(nèi)膜中cyclinB1和 MMP-2蛋白的表達，促進P21蛋白的表達

免疫組化實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，棕黃色顆粒光密度明顯增強，球囊損傷組新生內(nèi)膜中cyclinB1的蛋白表達明顯增多；而Am80組中，cyclinB1的表達與損傷模型組比較明顯減少。而且在Western blot的實驗中發(fā)現(xiàn)，Am80可以抑制cyclinB1和MMP-2的表達，但促進P21蛋白的表達。提示Am80可以通過抑制cyclinB1的蛋白表達而促進P21的表達,進而抑制細胞周期，見圖4。

Figure 4.The protein expression (n=6) of cyclinB1, MMP-2 and P21 in the carotid arteries on day 28 after balloon injury and immunohistochemistry staining (n=3) of cyclinB1 in the carotid arteries (×200). Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsinjuried group.

圖4 各組中cyclinB1、MMP-2和P21的蛋白表達以及免疫組化實驗結(jié)果

討 論

血管內(nèi)膜的異常增殖是許多血管增殖性疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術術后再狹窄、血管移植術后新生內(nèi)膜形成等發(fā)生發(fā)展的重要的細胞病理學基礎。血管內(nèi)膜的異常增殖主要是血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞異常增生所致。所以，了解血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞異常增生的分子機制對防治血管增殖性疾病非常重要。

維甲酸衍生物Am80是RARα的特異性激動劑。研究表明，Am80通過RARα能誘導細胞的分化[9]，同時，Am80也可以不通過RARα而通過其它通路來誘導細胞的分化[2,10]。我們前期的研究也顯示，Am80可通過促進KLF4與RARα的相互作用而阻止血管新生內(nèi)膜形成。但是對Am80通過什么通路、如何抑制血管內(nèi)皮細胞增殖的分子機制知之甚少。細胞的異常增生可導致多種疾病的發(fā)生，維持細胞數(shù)目的穩(wěn)態(tài)需要維持增殖和凋亡平衡，而增殖和凋亡的作用均依賴于細胞周期。P21作為細胞周期的負調(diào)控因子,與細胞凋亡密切相關。P21是細胞周期蛋白激酶抑制因子，P21不僅可直接抑制細胞周期蛋白激酶的活化，而且還能與DNA聚合酶σ的輔助因子增殖細胞核抗原結(jié)合，直接抑制DNA合成[11-12]。新的研究表明，P21與CK2蛋白相互作用影響組蛋白去乙?；?的乙?；瘡亩ㄟ^調(diào)控KLF4的乙?；?，進而抑制膀胱癌細胞的增殖[13]。而且在P21啟動子的核心序列-150 bp內(nèi)有GKLF家族結(jié)合的DNA序列，我們前期的研究已經(jīng)證實，Am80可以促進核轉(zhuǎn)錄因子KLF4與RARα的相互作用從而抑制血管內(nèi)膜的增生，從而我們推測，Am80也可能通過促進轉(zhuǎn)錄因子KLF4在P21啟動子上與GKLF結(jié)合位點結(jié)合，從而促進P21的轉(zhuǎn)錄活性。在本研究中我們證實了Am80的抗增殖活性，而且也發(fā)現(xiàn)Am80可促進P21的表達，這可能是其阻滯細胞周期調(diào)控的機制之一。

CyclinB1是第1個被發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白，研究表明，cyclinB1主要參與細胞周期檢測點的調(diào)控，并維持基因組的穩(wěn)定性[14]。而且在細胞周期進程中，cyclinB1的mRNA水平與蛋白水平呈平行變化，也就是說，細胞周期不同階段的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白可以結(jié)合于其啟動子的不同區(qū)域，從而調(diào)控細胞周期不同時期的轉(zhuǎn)換。而且研究表明，過表達cyclinB1能促進細胞周期中G2/M期的轉(zhuǎn)換，甚至導致細胞增生的失控或者惡化[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予內(nèi)皮細胞Am80刺激后，cyclinB1的表達水平明顯呈時間和濃度依賴方式下降，而且流式細胞術檢測細胞周期分布時也發(fā)現(xiàn)，給予Am80刺激24 h后，細胞周期停滯在G2/S期，以上結(jié)果也表明了，Am80通過降低內(nèi)皮細胞中cyclinB1的表達，從而影響了內(nèi)皮細胞中G2/S期的轉(zhuǎn)換，進而影響細胞的增殖。通過體內(nèi)動物模型實驗我們也證實了Am80可以通過降低血管內(nèi)膜中cyclinB1的表達而抑制血管內(nèi)膜的增生。MMP-2以無活性的酶原形式存在，一旦被激活后，可以水解許多細胞外基質(zhì)成分，從而促進細胞的遷移。在本研究中，Am80刺激可抑制MMP-2的表達。

通過本研究，我們證實了Am80可以在正常血管內(nèi)皮細胞中通過提高P21蛋白而抑制cyclinB1蛋白的表達，從而間接使內(nèi)皮細胞的細胞周期停滯在G2/S期中，進而減少了內(nèi)皮細胞數(shù)目的增多并抑制了球囊損傷造成的血管內(nèi)膜的異常增殖。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

Inhibitory effects of Am80 on proliferation in vascular endothelial cells and neointima hyperplasia of carotid arteries

WANG Ying1, Lü Xin-rui2

(1TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:lvxinrui@126.com)

AIM: To explore the inhibitory effects of Am80 on the proliferation in the vascular endothelial cells (VECs) and neointima hyperplasia of the carotid arteries after balloon injury in the rats. METHODS: The proliferation of EA-hy926 cells were detected by cell counting and MTS assay after the cells were treated with various doses of Am80 for 24 h. The cell cycle was analyzed by flow cytometry after the cells were stained with PI. The mRNA expression of cyclinB1, P21 and matrix metalloproteinase (MMP)-2 in the EA-Hy926 cells was detected by real-time PCR. The changes of neointima hyperplasia in the carotid arteries were observed under microscope with hemotoxylin and eosin (HE) staining, and the expression of cyclinB1 was examined by the method of immunohistochemistry. RESULTS: The proliferation of EA-Hy926 cells was obviously inhibited in a dose-dependent manner when the cells were treated with various doses of Am80 for 24 h. The cell cycle was arrested at G2/S stage in response to Am80 treatment. The mRNA expression of P21 was increased, however, the mRNA expression of cyclinB1 and MMP-2 was decreased when the cells were treated with Am80 at 4 μmol/L for various times. In addition, thevivoexperiment demonstrated that Am80 not only significantly reduced neointimal hyperplasia and the thickness ratio of intima to tunicae media compared with injured group, but also inhibited cyclinB1 expression in the carotid arteries. CONCLUSION: Am80 inhibits the proliferation of VECs and neointima hyperplasia in the carotid arteries after balloon injury by promoting P21 expression and decreasing cyclinB1 expression.

Am80; Vascular endothelial cells; Neointima hyperplasia; Cell cycle

1000- 4718(2016)12- 2205- 06

2016- 08- 17

2016- 11- 03

國家自然科學基金資助項目(No. U1404310; No. 81600940)；河南大學博士啟動基金(No. B2013043)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.013

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△通訊作者 Tel: 0371-23880585； E-mail: lvxinrui@126.com