摘要：以鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vtg）為抗原，卵黃蛋白原抗血清為抗體，建立了檢測鰱魚體內(nèi)卵黃蛋白原的間接酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）方法，組裝卵黃蛋白原ELISA試劑盒，并對其性能進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，建立的ELISA間接法檢測濃度為6.1～396.0 ng/mL，靈敏度為6.1 ng/mL，且在該范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，在系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品中添加1%蔗糖、20%甘油和0.000 5% MgCl2時，試劑盒在37 ℃條件下放置7 d，其標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度和線性基本保持不變，說明篩選的該穩(wěn)定劑配方對ELISA試劑具有良好的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）；卵黃蛋白原；酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)；穩(wěn)定劑

中圖分類號：S965.113 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3490-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.057

魚類卵黃蛋白原（Vitellogenin，VTG）是卵黃蛋白的前體，是卵黃形成期雌激素刺激下由肝臟合成的一種大分子量的磷酸脂糖蛋白，通過血液運(yùn)輸?shù)桨l(fā)育的卵巢中，被卵巢吸收，作為胚胎發(fā)育的營養(yǎng)源[1]。雌性動物卵黃生成期可合成大量VTG，而在其他生活期及雄性動物體內(nèi)VTG的含量卻很低。在人工雌激素或低劑量的類雌激素長期作用下，雄性動物和幼年動物也能誘導(dǎo)體內(nèi)VTG的生成。由于雄性動物沒有卵巢，無法有效吸收并清除血液中的VTG，使其濃度大幅升高。這一特性為檢測水生環(huán)境化學(xué)污染物的雌激素效應(yīng)提供了有效方法[2]。

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是目前最常用的VTG檢測方法[3-5]，其主要優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng)，靈敏度高。本試驗(yàn)以鰱魚VTG抗血清為抗體，以鰱魚VTG為抗原和標(biāo)準(zhǔn)品建立了間接ELISA方法，研制出了一種快速檢測鰱魚體內(nèi)卵黃蛋白原含量的試劑盒，為環(huán)境雌激素的評估與檢測提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、藥品及儀器

用于樣品檢測的雌、雄鰱魚購自湖北工業(yè)大學(xué)南門菜市場。

卵黃蛋白原、卵黃蛋白原抗血清自制；HRP標(biāo)記的IgG抗體購自武漢捷誠生物科技有限公司；TMB顯色液A液、B液、HRP標(biāo)記物稀釋液均購自洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；牛血清白蛋白（BSA）購自Bovogen公司；胎牛血清購自Bioind公司；pH 7.5 Tris-Hcl包被緩沖液、pH 7.5 TBST抗體稀釋液、洗滌緩沖液、2 mol/L硫酸終止液自配；蔗糖、甘油、氯化鎂、明膠、EDTA、氯化鈉、PEG4000等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；8×12酶標(biāo)板購自JETBIOFIL公司；Sunrise 2 酶標(biāo)儀購自瑞士帝肯公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 間接ELISA操作步驟

1）包被。用包被緩沖液稀釋抗原成一系列濃度，向酶標(biāo)板的每孔中加入100 μL稀釋好的抗原，然后將酶標(biāo)板放入37 ℃恒溫箱中孵育2 h。

2）洗滌。包被完后倒出孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌緩沖液220 μL，振蕩12～15 s，倒出洗滌緩沖液。重復(fù)洗滌3～5次，洗完后拍干。

3）加VTG抗血清（一抗）。用抗體稀釋液將VTG抗血清稀釋成一系列濃度，向酶標(biāo)板的每孔中加入100 μL稀釋好的抗體，然后將酶標(biāo)板放入37 ℃恒溫箱中孵育20 min。孵育完后按照步驟2洗滌3～5次，洗完后拍干。

4）加酶標(biāo)抗體（二抗）。向酶標(biāo)板的每孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗100 μL，在37 ℃恒溫箱中孵育20 min。孵育完后按照步驟2洗滌3～5次，洗完后拍干。

5）加底物液顯色。在酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔中加入TMB顯色A液50 μL，B液50 μL，于37 ℃恒溫箱中孵育15 min。

6）終止反應(yīng)。于各反應(yīng)孔中加入50 μL的終止液終止顯色。

7）結(jié)果判定。根據(jù)顯色深淺判斷陽性和陰性。在ELISA檢測儀上，于450 nm處測定各孔的光密度值。

1.2.2 抗血清與包被抗原的最佳工作濃度的篩選 用棋盤滴定法測定[6]，稀釋抗原，橫向包被酶標(biāo)板，陰性對照只加入抗原稀釋液，包被完后將稀釋的抗血清縱向逐孔加入板孔，按照“1.2.1”的ELISA間接法進(jìn)行，最后在酶標(biāo)儀上讀出各孔OD450 nm值，選擇OD450 nm值在1.0左右的抗原抗體組合進(jìn)一步制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定抗原的最佳包被濃度和血清的稀釋度。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按照ELISA間接法進(jìn)行，將VTG稀釋成一系列濃度后包被在酶標(biāo)板上，于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，陰性對照只加入包被液，VTG抗血清的濃度為最佳工作濃度，酶標(biāo)二抗羊抗兔的工作濃度為1∶2 000。

1.2.4 樣品的檢測 考慮到鰱魚血清里卵黃蛋白原濃度較高，檢測樣品時需用包被液將鰱魚樣品的血清稀釋至檢測范圍內(nèi)再進(jìn)行檢測，按以上建立的ELISA間接法進(jìn)行VTG的定量分析。

1.2.5 卵黃蛋白原ELISA試劑盒的配置 本試驗(yàn)研制的卵黃蛋白原試劑盒包括：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品工作液、抗體工作液、酶標(biāo)試劑、顯色液、終止液等。

1.2.6 間接法測定ELISA試劑盒的穩(wěn)定性 取同一批次的兩組試劑盒，分別保存在4 ℃冰箱和37 ℃恒溫箱里，保存7 d。在第0、2、4、5、7天測定兩組試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)的OD變化以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗血清和包被抗原最佳工作濃度確定

最適工作濃度判定的標(biāo)準(zhǔn)為陽性對照OD450 nm為1.0，陰性對照OD450 nm小于0.1，而抗原、抗體濃度最低即為最適工作濃度。用棋盤法測定的結(jié)果見表1。將OD450 nm在1.0左右的抗原、抗體組合進(jìn)行比較后，選擇VTG抗血清的稀釋度為1∶4 000、1∶8 000、 1∶16 000。然后再根據(jù)表1，選擇上述3個抗血清濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步確定抗體的最佳工作濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。當(dāng)抗體濃度為1∶8 000時，在396 ng/mL與6.1 ng/mL之間曲線的靈敏度和檢測范圍良好，因此在ELISA檢測中，采用1∶8 000的抗血清濃度。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用包被緩沖液將抗原稀釋至396、198、99、49.5、24.75、12.375、6.187 5 ng/mL，包被酶標(biāo)板，抗血清稀釋度為1∶8 000，按照ELISA間接法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以標(biāo)準(zhǔn)VTG濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D450 nm為縱坐標(biāo)，抗血清ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為y=0.027 1x-0.102 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。

2.3 樣品的檢測

將雌魚樣品血清稀釋20 000倍，雄魚樣品血清稀釋2 000倍，包被酶標(biāo)板，抗血清稀釋度為1∶8 000，按照ELISA間接法進(jìn)行檢測。樣品檢測結(jié)果為雌魚樣品血清VTG濃度為943.4 μg/mL，雄魚樣品血清VTG濃度為40.7 μg/mL。

2.4 卵黃蛋白原ELISA試劑盒的配置

卵黃蛋白原ELISA試劑盒的配置如表2所示。

2.5 間接法ELISA試劑盒的穩(wěn)定性

同一批次兩組試劑盒保存在4 ℃冰箱和37 ℃恒溫箱里7 d的結(jié)果如表3所示，從表3中可以看出，在穩(wěn)定性試驗(yàn)第2天，試劑盒里抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗血清結(jié)合的活性快速下降，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到市場的要求。因此，進(jìn)一步考慮在試劑盒里添加穩(wěn)定劑成分。

2.5.1 影響試劑盒穩(wěn)定性的主要因素 影響試劑盒穩(wěn)定性的因素主要是卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品和抗血清兩個方面的因素，為了找出對試劑盒穩(wěn)定性影響較大的因素，分別在第0、2、4、5、7天現(xiàn)配制卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品或抗血清，而試劑盒其他成分則放置在4 ℃冰箱和37 ℃恒溫箱里，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。從表4、表5中可以看出，當(dāng)抗原標(biāo)準(zhǔn)品現(xiàn)配，而抗血清存放在37 ℃恒溫箱加速破壞的時候，在第7天，系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗血清還有很高的結(jié)合活性；反之，當(dāng)系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品放在37 ℃恒溫箱加速破壞的時候，系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗血清結(jié)合活性則快速下降。因此，可以判斷影響試劑盒穩(wěn)定的因素主要是系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定，活性下降比較快。

2.5.2 穩(wěn)定劑的篩選 選取常用保護(hù)劑，按表6配制7種穩(wěn)定劑，并設(shè)空白對照，各種穩(wěn)定劑用包被緩沖液配制而成。將系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品分別用4種穩(wěn)定劑配制，37 ℃恒溫箱中進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)，空白系列標(biāo)準(zhǔn)品用包被緩沖液配制，分別在第0、2、4、5、7天取出8種系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品，按照間接ELISA方法進(jìn)行測定，檢測系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品的活性。以最高濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品OD450 nm為縱坐標(biāo)，破壞時間為橫坐標(biāo)作圖，比較最高濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品在不同破壞時間活性的變化，縮小篩選范圍。

從圖2中可以看出，穩(wěn)定劑1和穩(wěn)定劑7對最高濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品的活性有明顯的穩(wěn)定效果。對這兩種穩(wěn)定劑配成的系列抗原標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，結(jié)果見表7、表8。穩(wěn)定劑1在加速破壞試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度和線性關(guān)系良好，未發(fā)生很大變化，而穩(wěn)定劑7的標(biāo)準(zhǔn)曲線靈敏度發(fā)生較大變化。因此，最終選定穩(wěn)定劑1作為試劑盒的穩(wěn)定劑配方。試驗(yàn)結(jié)果證明，穩(wěn)定劑有明顯的保護(hù)作用， 對延長試劑盒的貨架期具有一定價值。

3 小結(jié)與討論

ELISA基于抗原-抗體的特異性反應(yīng)，以其快速、靈敏、簡便等優(yōu)點(diǎn)，已成為雌激素檢測技術(shù)研究的熱點(diǎn)[7-10]。目前，對食蚊魚[11]、劍尾魚[12]、鰨（Pleuronectes vetulus）[4]等多種魚類建立了ELISA方法來檢測魚體內(nèi)VTG。本試驗(yàn)以鰱魚VTG作為抗原，以VTG抗血清作為抗體，建立了間接ELISA法，包括抗血清和包被抗原最佳工作濃度的篩選以及ELISA工作標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的ELISA間接法檢測濃度為6.1～396 ng/mL，靈敏度為6.1 ng/mL。穩(wěn)定性研究是診斷試劑盒質(zhì)量研究的一個重要內(nèi)容，也是確定試劑盒保存條件和有效期的唯一依據(jù)[13]。在加速破壞試驗(yàn)中當(dāng)不添加任何穩(wěn)定劑時，試劑盒活性快速下降。為了延長試劑盒的貨架期，考慮添加一些穩(wěn)定劑保護(hù)試劑盒活性。常用的各種穩(wěn)定劑成分中，糖類的多個羥基可與蛋白質(zhì)結(jié)合的水分子相互作用，從而對蛋白質(zhì)類物質(zhì)起到保護(hù)作用；甘油能保持抗原表面的滋潤，防止其失水而失活；大分子物質(zhì)，如PEG能在抗原表面形成一種保護(hù)膜，從而使其結(jié)構(gòu)免遭破壞；離子螯合劑，如EDTA也有抗氧化防腐的功效。本試驗(yàn)中通過組合各種穩(wěn)定劑成分，篩選出了一種穩(wěn)定劑1%蔗糖+20%甘油+0.000 5%MgCl2，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，該穩(wěn)定劑能使試劑盒在加速破壞試驗(yàn)中保持其活性不變，具有良好的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 廖 濤.典型內(nèi)分泌干擾物對稀有鮈鯽和斑馬魚毒性影響的比較研究及其應(yīng)用[D].武漢：中國科學(xué)院水生生物研究所，2007.

[2] MITSUI N，TOOI O，KAWAHARA A. Sandwich ELISAs for quantification of Xenopus laevis vitellogenin and albumin and their application to measurement of estradiol-17 beta effects on whole animals and primary-cultured hepatocytes[J]. Comp Biochem Physiol C：Toxicol Pharmacol，2003，135（3）：305-313.

[3] BON E，BARBE U，NUNEZ RODRIGUEZ J，et al. Plasma vitellogenin levels during the annual reproductive cyle of the female rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）： Establishment and validation of an ELISA[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，1997，117（1）：75-84.

[4] LOMAX D P，ROUBAL W T，MOORE J D，et al. An enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for measuring vitellogenin in English sole（Pleuronectes vetulus）：Development，validation and cross-reactivity with other pleuronectids[J].Comparative Biochemistry and Physiology，1998，121（4）：425-436.

[5] SHERRY J，GAMBLE A，F(xiàn)IELDEN M，et al. An ELISA for brown trout （Salmo trutta） vitellogenin and its use in bioassays for environmental estrogens[J].The Science of the Total Environment，1999，225：13-31.

[6] LOWRY O H，ROSEBROUGH N J，F(xiàn)ARR A L，et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry，1951，193（1）：265-275.

[7] 張 麗.關(guān)于體外診斷試劑的穩(wěn)定性研究[J].中國新藥雜志，2006（22）：1899-1900.

[8] HUANG C H，SEDLAK D L.Analysis of estrogenic hormones in municipal wastewater effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography tandem mass spectrometry[J].Environmental Toxicology and Chemistry，2001，20（1）：133-139.

[9] FARR？魪 M，KUSTER M，BRIX R，et al.Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit，liquid chromatography-tandem mass spectrometry，and ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples[J].Journal of Chromatography A，2007，1160（1-2）：166-175.

[10] SWART J C，POOL E J，VAN W J H.The implementation of a battery of in vivo and in vitro bioassays to assess river water for estrogenic endocrine disrupting chemicals[J].Ecotoxieology and Environmental Safety，2011，74（1）：138-143.

[11] 戴更輝.食蚊魚（Gambusia affinis）卵黃蛋白原的誘導(dǎo)及其在環(huán)境激素檢測中的應(yīng)用[D].上海：華東師范大學(xué)，2005.

[12] 溫茹淑，方展強(qiáng)，江世貴，等.劍尾魚卵黃蛋白原的ELISA檢測[J].環(huán)境科學(xué)研究，2007，20（4）：142-147.

[13] FRANK F，HATLEY R H M，MATHIAS S F.Materials science and the production of shelf-stable biologicals[J].Pharm Technol Int，1991，3：24-34.