摘要：CYP27B1是血清活性維生素D3合成的關(guān)鍵酶，根據(jù)GenBank報(bào)道的序列設(shè)計(jì)特異引物，以HepG2細(xì)胞的cDNA為模板，擴(kuò)增CYP27B1的編碼區(qū)，構(gòu)建CYP27B1的真核表達(dá)載體，在293T細(xì)胞表達(dá)并檢測(cè)其催化活性。結(jié)果表明，重組表達(dá)載體pcDNA-CYP27B1構(gòu)建成功，pcDNA-CYP27B1及對(duì)照質(zhì)粒pcDNA分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明CYP27B1在293T成功表達(dá)。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示重組表達(dá)的CYP27B1能羥化25（OH）D3生成1α，25（OH）2D3。

關(guān)鍵詞：CYP27B1；真核表達(dá)載體；羥化；HPLC

中圖分類號(hào)：Q554 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）13-3486-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.056

維生素D是一種脂溶性維生素，屬于類固醇化合物，又稱抗佝僂病維生素[1]。在動(dòng)物體體內(nèi)，皮膚中的7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外照射轉(zhuǎn)化為維生素D3。此外，維生素D3來源于一些食物，如魚、動(dòng)物肝臟、奶制品、酵母、蘑菇等[2，3]。維生素D的生理功能是調(diào)節(jié)鈣磷代謝，通過促進(jìn)腸的鈣磷吸收和腎的重吸收以提高血漿鈣磷離子濃度[4]。近年來，也發(fā)現(xiàn)1α，25（OH）2D3在腎外組織及細(xì)胞中發(fā)揮重要的生物功能，如調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的分化、增殖或功能。研究發(fā)現(xiàn)腎外活性維生素D的調(diào)控作用與腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎效應(yīng)等相關(guān)[5，6]，因此，吸引了學(xué)者研究1α羥化酶表達(dá)水平與疾病尤其是腫瘤發(fā)生的相關(guān)性，據(jù)報(bào)道維生素D依賴型佝僂病1（VDDR1）和假性維生素D依賴型佝僂?。≒DDR）與1α羥化酶活基因突變相關(guān)[7，8]。

維生素D3沒有生物活性，為了發(fā)揮其生物效應(yīng)，必須被代謝成具有生物活性形式的維生素D。首先，維生素D3與維生素D3結(jié)合蛋白（DBP）結(jié)合，轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，被細(xì)胞色素P450羥化為初具生物活性的25-hydroxyvitamin D（25（OH）D3），25（OH）D3是維生素D的主要循環(huán)形式，臨床上應(yīng)用25（OH）D3反映體內(nèi)維生素D的營養(yǎng)狀態(tài)[5，9]，25（OH）D3被轉(zhuǎn)運(yùn)到腎臟，被1α羥化酶CYP27B1轉(zhuǎn)化為最強(qiáng)生物活性的1α，25（OH）2D3[10]。

CYP27B1是線粒體膜蛋白質(zhì)，哺乳動(dòng)物線粒體單氧酶系統(tǒng)包括NADPH-鐵氧還蛋白還原酶（Adr）和鐵氧還蛋白（Adx）和P450，電子從NADPH經(jīng)Adr和Adx傳遞到P450[11]。Tang等[12]應(yīng)用GroEL/ES作為分子伴侶在大腸桿菌中成功地將CYP27B1與Adx和Adr共表達(dá)，并且獲得部分純化的異源表達(dá)重組蛋白。但是，真核體系表達(dá)的蛋白具有天然構(gòu)象并且不需要分子伴侶與電子傳遞體共表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，所以本研究應(yīng)用PCR擴(kuò)增CYP27B1的編碼區(qū)，構(gòu)建其表達(dá)載體pcDNA-CYP27B1，重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，HPLC檢測(cè)其催化活性，為研究CYP27B1表達(dá)量對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞購和293T細(xì)胞購（ATCC公司），維生素D3和25（OH）D3（Sigma公司），1α，25（OH）2D3（Santa Cruz公司），pcDNATM 3.1/myc-His（-）A vector和Trizol（Invitrogen公司），限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ（Takara公司），高保真酶KOD FX（Toyobo公司），K1621 RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒（Thermo公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素和鏈霉素（Gibco公司），Myc抗體、HRP標(biāo)記的小鼠抗山羊IgG（碧云天生物科技有限公司），PVDF（Millipore公司），DNA膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒和微量質(zhì)粒提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，GenEscortTMⅠ（Polysciences公司），甲醇為色譜級(jí)，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)：DMEM完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL鏈霉素），37 ℃，5% CO2。復(fù)蘇的細(xì)胞鋪板率達(dá)90%以上，0.25%胰酶消化，1×104個(gè)/孔細(xì)胞接種于六孔板，生長48 h后，收集細(xì)胞用于RNA提取。293T細(xì)胞培養(yǎng)條件同HepG2細(xì)胞。

1.2.2 表達(dá)載體構(gòu)建 采用Trizol法從HepG2細(xì)胞中提取總RNA，詳細(xì)步驟參照Trizol的說明書，反轉(zhuǎn)錄按照K1621 RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒說明操作。根據(jù)NCBI報(bào)道的CYP27B1的序列（登錄號(hào)：1594），設(shè)計(jì)特異性引物F（5′-CCGCTCGAGATGACCCAGACCCTCAAGTACGC-3′）、R（5′-CGGGATCCTCTGTCCAAAAACTGTAGGTTGATGC-3′），在編碼區(qū)的5′和3′端分別引入XhoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，并去掉CYP27B1編碼區(qū)的TGA，在CYP27B1的3′端融合載體的myc-His標(biāo)簽，利用載體的終止子終止翻譯。以HepG2的cDNA為模板，用KOD FX高保真酶擴(kuò)增CYP27B1的編碼區(qū)，55 ℃退火，其他步驟參見說明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收CYP27B1片段。XhoⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物和pcDNATM 3.1/myc-His（-）A載體過夜，DNA純化試劑盒回收酶切產(chǎn)物。將回收的CYP27B1雙酶切產(chǎn)物與回收的pcDNATM 3.1/myc-His（-）A載體的雙酶切產(chǎn)物連接過夜，轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)中，37 ℃生長16 h后，菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測(cè)序，保存序列正確的質(zhì)粒。

1.2.3 293T細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 傳代后的第二天，細(xì)胞鋪板率達(dá)到60%以上，但是生長不能超過24 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。10 cm平皿， 8 μg質(zhì)粒，24 μL GenEscortTMⅠ（PEI），詳細(xì)操作步驟參見GenEscortTMⅠ的說明書。轉(zhuǎn)染24 h后加入終濃度為1 μmol/L 25（OH）D3，孵育24 h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，加入4倍體積的抽提液（體積比為3∶1的氯仿和甲醇）渦旋振蕩2 min，室溫3 000 r/min離心10 min. 有機(jī)相在氮?dú)饬飨麓蹈?，加?00 μL甲醇溶解，10 μL用于HPLC檢測(cè)。

1.2.4 Western-blot檢測(cè) pcDNA-CYP27B1和空載體pcDNA轉(zhuǎn)染后48 h，PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞，用PBS懸浮，超聲破碎，總蛋白質(zhì)濃度用Bradford方法測(cè)定。在5 μg蛋白質(zhì)樣品中加入等體積的Loading buffer混勻后煮沸失活，樣品用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶4 ℃封閉過夜，TBST洗膜3次；將myc抗體稀釋1 000倍，室溫孵育2 h，洗膜3次；HRP標(biāo)記的小鼠抗山羊IgG稀釋3 000倍，室溫孵育2 h，洗膜3次。

1.2.5 HPLC檢測(cè) 采用安捷倫1200液相色譜儀，ZORBAX Eclipse Plus C18 column色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流速1 mL/min，檢測(cè)波長265 nm，流動(dòng)相 A為水，流動(dòng)相B為甲醇。0～10 min，85%～100%甲醇；10～18 min 100%甲醇洗脫，柱溫40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYP27B1真核表達(dá)載體構(gòu)建

以HepG2的cDNA為模板，應(yīng)用引物F和R擴(kuò)增CYP27B1的編碼區(qū)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，獲得約1 500 bp的目的條帶，得到預(yù)期大小的產(chǎn)物（GenBank報(bào)道的CYP27B1的編碼區(qū)為1 527 bp），如圖1所示。將目的片段電泳后回收連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物為CYP27B1基因，在編碼區(qū)3′端融合了載體的myc-His。

2.2 Western-blot檢測(cè)重組蛋白表達(dá)

5 μg蛋白質(zhì)樣品中加入等體積的Loading buffer，混勻后煮沸失活，樣品用SDS-PAGE分離，再經(jīng)Western-blot鑒定。CYP27B1編碼區(qū)編碼508個(gè)氨基酸，分子量為56.504 21 kDa的蛋白質(zhì)，重組蛋白質(zhì)3′端具有myc-His標(biāo)簽，編碼59 938.9 kDa大小的重組蛋白，用Myc抗體作為一抗，經(jīng)Western-blot檢測(cè)到預(yù)期大小的目的蛋白，如圖2所示，表明CYP27B1在293T細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.3 CYP27B1生物活性檢測(cè)

pcDNA-CYP27B1和空載體pcDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后加入終濃度為1 μmol/L的25（OH）D3，孵育24 h，加入抽提液終止反應(yīng)，抽提底物和產(chǎn)物。pcDNA-CYP27B1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的提抽物中檢測(cè)到了1α，25-雙羥基維生素D3，對(duì)照空載體pcDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T的提抽物中未檢測(cè)到1α，25-雙羥基維生素D3，3次重復(fù)。結(jié)果（圖3、圖4）表明，在293T異源重組表達(dá)CYP27B1中能催化25（OH）D3在C-1a位單加氧生成1α，25-雙羥基維生素D3。

3 討論

人CYP27B1的cDNA全長包含9個(gè)外顯子，全長2 503 bp，包括 152 bp 的5′端的非編碼區(qū)，1 527 bp的開放閱讀框架序列，824 bp的3′端的非編碼區(qū)。 CYP27B1除了在腎表達(dá)外，在肝等腎外組織也表達(dá)。Tang等[12]應(yīng)用化學(xué)合成CYP27B1的編碼區(qū)，并且原核表達(dá)CYP27B1。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性引物以HepG2細(xì)胞的cDNA為模板，用KOD FX高保真酶擴(kuò)增CYP27B1的編碼區(qū)，KOD FX與一般高保真酶相比，擴(kuò)增效率高。本試驗(yàn)采用293T細(xì)胞作宿主，因?yàn)?93T細(xì)胞是常用的宿主細(xì)胞，容易培養(yǎng)。pcDNA3.1pcDNATM 3.1/myc-His（-）A為真核表達(dá)載體（pcDNA）含有T-7啟動(dòng)子，并且具有表達(dá)標(biāo)簽Myc和His，便于鑒定和純化，高效表達(dá)重組融合蛋白。本試驗(yàn)將CYP27B1在293T細(xì)胞成功表達(dá)，并且具有羥化25（OH）D3生成1α，25-雙羥基維生素D3的能力，為進(jìn)一步研究CYP27B1表達(dá)量對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響提供參考。

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