摘要：冬蟲(chóng)夏草[Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc.]菌培養(yǎng)過(guò)程中，蝙蝠蛾擬青霉菌株SH-1的菌絲產(chǎn)生粉紅色變化的現(xiàn)象，粉紅菌株與SH-1菌株形態(tài)上存在很大差異，為查明產(chǎn)生的原因，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、光照、pH和裝液量對(duì)粉紅色變化的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化冬蟲(chóng)夏草真菌的培養(yǎng)環(huán)境，分析影響粉紅色變化的關(guān)鍵因素。結(jié)果表明，產(chǎn)生粉紅變化的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間80 d、培養(yǎng)溫度20.55 ℃、pH 7.51、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1產(chǎn)生概率為35.14%；得出菌株ZH-1的最大得率培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間80 d、培養(yǎng)溫度為22.25 ℃、pH 6.89、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1得率為8.95%。

關(guān)鍵詞：冬蟲(chóng)夏草菌[Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc.]；響應(yīng)面法；蝙蝠蛾擬青霉；培養(yǎng)條件；粉紅色變化

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.3+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）13-3420-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.038

冬蟲(chóng)夏草[Cordyceps sinensis（BerK.） Sacc.]為真菌界（Fungi）子囊菌綱（Asocmycotetes）肉座菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clvaieipiacteae）冬蟲(chóng)夏草屬（Cordyceps）的蝙蝠蛾擬青霉寄生在蝙蝠娥科昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合體，具有補(bǔ)肺益腎、止血化痰的功效，可用于久咳虛喘、陽(yáng)痿遺精、腰膝酸痛的治療[1]。冬蟲(chóng)夏草主要分布在中國(guó)青海、西藏、四川、甘肅等海拔3 000～5 000 m的地區(qū)，冬蟲(chóng)夏草是主產(chǎn)區(qū)群眾經(jīng)濟(jì)來(lái)源的重要組成部分[2]。近年來(lái)，冬蟲(chóng)夏草被過(guò)度采挖，使冬蟲(chóng)夏草野生資源瀕臨枯竭，野生冬蟲(chóng)夏草生產(chǎn)面積正在逐年縮小，產(chǎn)量也隨之下降[3]。

冬蟲(chóng)夏草菌無(wú)性型的分離與鑒定工作在多年以前就已進(jìn)行[4，5]，分離到的冬蟲(chóng)夏草真菌菌絲體是天然冬蟲(chóng)夏草的替代品，其成分、含量與天然冬蟲(chóng)夏草非常相似[6]。在靜止培育冬蟲(chóng)夏草菌株SH-1的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)部分培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)菌絲體生長(zhǎng)到一定時(shí)期，從中間開(kāi)始轉(zhuǎn)化成粉紅色，逐步蔓延到瓶壁，原先的粗糙表面變成有張力、有韌性的光滑表面，富含水分，周?chē)中纬啥鄬用虪罱Y(jié)構(gòu)。隨著生長(zhǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物往往形成一個(gè)整體，周?chē)c瓶壁緊密結(jié)合，培養(yǎng)物顏色鮮艷，整體呈果凍狀，將產(chǎn)生變化后的粉紅色菌株編號(hào)為ZH-1。粉紅色變化影響了SH-1的正常生長(zhǎng)，為了查明產(chǎn)生的原因和可能存在的相互關(guān)系，本試驗(yàn)針對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中與菌株生長(zhǎng)有直接關(guān)系的培養(yǎng)基配方進(jìn)行研究，利用響應(yīng)面法分析配方組合對(duì)粉紅菌株產(chǎn)生的影響。Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法是通過(guò)多元線(xiàn)性擬合或二項(xiàng)式回歸分析來(lái)表達(dá)因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)方法[7，8]，可以明確任意兩個(gè)因素的交互作用，結(jié)果直觀(guān)、可靠，且試驗(yàn)效果好[9]。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、裝液量4個(gè)主要因素[10，11]，考察4個(gè)因素對(duì)粉紅菌株ZH-1產(chǎn)生的概率和得率、SH-1得率的影響，對(duì)影響粉紅菌株產(chǎn)生的概率和得率的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期找出適合粉紅菌株生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)條件，為下一步闡明兩個(gè)菌株之間的關(guān)系和探討產(chǎn)生的機(jī)理提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

供試菌種：冬蟲(chóng)夏草菌由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院純化培養(yǎng)，編號(hào)為SH-1，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所鑒定為蝙蝠蛾擬青霉，保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器：組培瓶、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、多功能光照培養(yǎng)箱、FA1004型電子分析天平。

分離用固體培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，自來(lái)水 1 000 mL，添加3 g牛肉膏。

培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基：每200 mL溶液中，土豆20 g、胡蘿卜10 g、氮源A 45 mL、氮源B 5 g、葡萄糖8 g、MgSO4為0.1 g、K2HPO4為0.4 g。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 冬蟲(chóng)夏草菌液體培養(yǎng)條件：500 mL的培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液200 mL，接種量10 mL，pH 5.8，培養(yǎng)溫度20 ℃，光照條件為自然光照，培養(yǎng)時(shí)間60 d。單因素試驗(yàn)每個(gè)處理134瓶，重復(fù)3次。響應(yīng)面試驗(yàn)每個(gè)處理20瓶，重復(fù)3次。

1.2.2 菌絲體生物量的測(cè)定 每個(gè)處理菌絲體在生長(zhǎng)到60 d以后，收集已長(zhǎng)成菌塊的菌絲體，用去離子水洗滌3次，60 ℃條件下干燥至恒重，即為菌絲體干重。

1.2.3 產(chǎn)生概率和得率的計(jì)算

概率=■×100%

得率=■×100%

式中，M為收取的菌絲體干重（g），V為平均裝液量（mL）。

1.2.4 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 冬蟲(chóng)夏草菌的培養(yǎng)過(guò)程中，影響粉紅菌株可能的因素有培養(yǎng)時(shí)間、光照條件、培養(yǎng)溫度、pH及裝液量，對(duì)這些條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1）培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定光照為自然光，溫度20 ℃，pH 5.8，裝液量200 mL，選擇培養(yǎng)時(shí)間為20、40、60、80、100 d 進(jìn)行試驗(yàn)。

2）光照條件對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時(shí)間為60 d，溫度20 ℃，pH 5.8，裝液量200 mL，選擇光照條件為無(wú)光照、自然光照、全日光照進(jìn)行試驗(yàn)。

3）培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時(shí)間為60 d，光照條件為自然光照，pH 5.8，裝液量200 mL，選擇培養(yǎng)溫度為5、10、15、20、25、30 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。

4）pH對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時(shí)間為60 d，光照條件為自然光照，培養(yǎng)溫度20 ℃，裝液量200 mL，選擇pH為4、5、6、7、8、9、10進(jìn)行試驗(yàn)。

5）裝液量對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響。固定培養(yǎng)時(shí)間為60 d，光照條件為自然光照，培養(yǎng)溫度20 ℃，pH 5.8，選擇裝液量為100、150、200、250、300 mL進(jìn)行試驗(yàn)。

應(yīng)用 Design-expert 8.0軟件，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，確定產(chǎn)生粉紅變化的最適培養(yǎng)條件以及影響粉紅菌株ZH-1得率的最適培養(yǎng)條件。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲(chóng)夏草菌培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖1可知，培養(yǎng)時(shí)間為60 d時(shí)SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大。圖2顯示，隨著時(shí)間的增加，菌株SH-1和ZH-1的得率也在增加，60 d后兩個(gè)株菌得率的增長(zhǎng)趨勢(shì)變緩，考慮到培養(yǎng)效率與成本，培養(yǎng)時(shí)間選擇60 d為宜。培養(yǎng)過(guò)程中，SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率由18.66%下降為13.43%，部分ZH-1在沒(méi)有完全覆蓋原來(lái)的菌蓋之前，又從邊緣開(kāi)始變白，重新生成正常菌絲，因此，ZH-1的數(shù)量隨時(shí)間的增長(zhǎng)而下降。

2.1.2 光照條件對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖3可知，光照條件對(duì)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率影響不大。圖4顯示，隨著光照條件的改變，菌株SH-1和ZH-1的得率沒(méi)有顯著變化，因此，選擇光照條件為自然光照。

2.1.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖5可知，不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率影響較大，在25 ℃時(shí)，變化概率最大。圖6顯示，低溫（小于10 ℃）時(shí)沒(méi)有產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1，隨著溫度的進(jìn)一步升高，菌株SH-1和ZH-1的得率呈先增加后降低的趨勢(shì)，但ZH-1的得率變化不顯著，因此，選擇培養(yǎng)溫度20 ℃為宜。

2.1.4 pH對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖7可知，pH為7時(shí)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大。圖8顯示，在pH為7時(shí)菌株ZH-1的得率產(chǎn)生最大值，而菌株SH-1的得率在pH為6時(shí)產(chǎn)生最大值。在pH為4和8時(shí)，沒(méi)有菌株ZH-1出現(xiàn)，說(shuō)明pH對(duì)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率影響較大，因此選擇pH 7為宜。

2.1.5 裝液量對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1概率及其得率的影響 由圖9可知，裝液量為300 mL時(shí)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的變化概率最大。圖10顯示，菌株ZH-1與SH-1的得率隨著裝液量的增加而增加，得率最大值都產(chǎn)生在裝液量為300 mL時(shí)，說(shuō)明裝液量對(duì)粉紅菌株ZH-1的產(chǎn)生和得率都有影響。

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析，篩選出培養(yǎng)時(shí)間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）、pH（X3）、裝液量（X4）4個(gè)主要因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法，以菌株SH-1產(chǎn)生菌株ZH-1的概率（Y1）和ZH-1的得率（Y2）為響應(yīng)值，考察影響產(chǎn)生粉紅菌株的培養(yǎng)條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)表3中回歸模型的方差分析可知，模型1的F=5.862 1，P<0.01，模型2的F=166.352 7，P<0.000 1，說(shuō)明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性。模型1的失擬項(xiàng)F=4.722 2，P=0.074 0>0.05，模型2的失擬項(xiàng)F=4.705 8，P=0.074 5>0.05，失擬項(xiàng)均不顯著，2個(gè)模型的決定系數(shù)R2值分別為0.854 3和0.994 0，說(shuō)明2個(gè)模型能夠解釋85.43%和99.40%的響應(yīng)值變化。因此，該模型擬合程度較好，可以用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)菌株ZH-1的產(chǎn)生概率和得率。在總的作用因素中，回歸方程一次項(xiàng)X1、X2、X4對(duì)菌株ZH-1產(chǎn)生概率的影響達(dá)到顯著或極顯著水平；回歸方程一次項(xiàng)X1、X2、X4，二次項(xiàng)X12、X22、X32和交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X1X4、X2X4對(duì)菌株ZH-1得率的影響達(dá)到顯著或極顯著水平，由F值的大小可以推斷3個(gè)因素影響菌株ZH-1得率（Y2）的大小順序?yàn)閄4>X2>X1。

試驗(yàn)所選用的4個(gè)因素，不僅影響到菌株SH-1產(chǎn)生菌株ZH-1的概率，而且對(duì)粉紅菌株ZH-1得率有影響。分別以Y1、Y2為響應(yīng)值，以X1、X2、X3、X4為因變量，通過(guò)擬合可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)方程，多元回歸擬合分析得到產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1的概率和ZH-1得率的二次方程（表4）。

2.3 因素間的交互影響

根據(jù)擬合模型繪制菌株ZH-1產(chǎn)生概率和得率響應(yīng)面三維圖與等高線(xiàn)，可直觀(guān)地看出響應(yīng)面的最高點(diǎn)，即參數(shù)范圍內(nèi)的極值以及因素間的相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，依次可以確定最適培養(yǎng)基配方條件范圍，采用Design-expert 8.0軟件處理后三維響應(yīng)面和等高線(xiàn)見(jiàn)圖11、圖12。

分析可知，培養(yǎng)溫度（X2）對(duì)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的概率影響極顯著，培養(yǎng)時(shí)間（X1）與裝液量（X4）對(duì)菌株SH-1產(chǎn)生ZH-1的概率影響顯著。培養(yǎng)時(shí)間（X1）、培養(yǎng)溫度（X2）與裝液量（X4）對(duì)粉紅菌株ZH-1的得率有極顯著影響，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡，即隨著元素含量的增加或減少，響應(yīng)值變化較大；其他項(xiàng)影響較小，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較為平滑。交互項(xiàng)影響中，對(duì)于粉紅菌株ZH-1的產(chǎn)生概率，交互作用不顯著。培養(yǎng)時(shí)間（X1）與培養(yǎng)溫度（X2）、培養(yǎng)時(shí)間（X1）與pH（X3）、培養(yǎng)時(shí)間（X1）與裝液量（X4）、pH（X3）與裝液量（X4）對(duì)菌株ZH-1得率有顯著的交互作用。

2.4 菌株ZH-1產(chǎn)生概率及得率的最適配方

確定通過(guò)軟件Design-expert 8.0求解方程，得出發(fā)生粉紅變化產(chǎn)生菌株ZH-1的最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間80 d、培養(yǎng)溫度20.55 ℃、pH 7.51、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1產(chǎn)生概率為35.14%；得出ZH-1的最大得率培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間80 d、培養(yǎng)溫度22.25 ℃、pH 6.89、裝液量250 mL，在此培養(yǎng)基條件下，粉紅菌株ZH-1得率為8.95%。

3 小結(jié)

本研究以冬蟲(chóng)夏草菌菌絲體生物量為量化指標(biāo)，從培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、光照條件、pH、裝液量5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法試驗(yàn)，建立了培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、裝液量4個(gè)因素與冬蟲(chóng)夏草粉紅菌株產(chǎn)生概率之間的數(shù)學(xué)模型，研究采用響應(yīng)面法確定環(huán)境因素影響粉紅菌株產(chǎn)生的可行性[12]。試驗(yàn)表明，模型的回歸效果顯著，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間與產(chǎn)生粉紅菌株有直接關(guān)系，可作為預(yù)測(cè)粉紅菌株產(chǎn)生的參考因子，4個(gè)因素的交互作用對(duì)產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1和ZH-1得率有一定的影響。試驗(yàn)確定了產(chǎn)生粉紅菌株ZH-1最適的培養(yǎng)條件和獲得ZH-1最大得率的培養(yǎng)條件。

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