摘要：采用菌絲生長(zhǎng)速率法，研究南艾蒿（Artemisia verlotorum Lamotte）乙醇提取物及其萃取物、乙酸乙酯相活性富集片段對(duì)田七（Panax notoginseng）主要病害病原菌的抑制作用。結(jié)果表明，10 mg/mL的南艾蒿乙醇提取物對(duì)田七炭疽病原膠孢炭疽菌（Colletotriehum gloeosporioides）、田七根腐病原茄鐮孢（Fusarium solani）、田七黑斑病原人參鏈格孢（Alternaria panax）的菌絲生長(zhǎng)抑制作用明顯，最大抑制率分別為89.66%、74.42%和75.93%；萃取物中乙酸乙酯萃取物對(duì)3種病原菌抑制率最大，分別為90.41%、82.68%、71.79%；富集片段F2在10 mg/mL濃度下對(duì)3種病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到100%。

關(guān)鍵詞：南艾蒿（Artemisia verlotorum Lamotte）；田七（Panax notoginseng）；生長(zhǎng)速率；抑制率

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）13-3337-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.017

田七[Panax notoginseng（Burk.）F.H. Chen]，在廣西百色市栽培的為人參屬植物三七，又名金不換，具有活血化瘀、消腫止痛功效，是中國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材[1]。以田七為主要原料制成的中成藥如云南白藥和片仔癀等廣為流傳。近年來(lái)由于田七的連作障礙問(wèn)題導(dǎo)致病害發(fā)生嚴(yán)重[2]，防治過(guò)程中濫用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致田七藥材農(nóng)藥殘留超標(biāo)。因此，開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥，減少化學(xué)農(nóng)藥使用是解決這一問(wèn)題的有效途徑。

植物中含有的大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)如萜烯類(lèi)、生物堿、類(lèi)黃酮甾體、酚類(lèi)等均具有殺蟲(chóng)和抗菌活性[3]。筆者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)有田七種植戶(hù)噴施艾蒿發(fā)酵液用來(lái)防治田七病害效果明顯。艾蒿在抑菌、殺菌活性方面的研究已有大量報(bào)道[4-6]，具有開(kāi)發(fā)為新型植物源農(nóng)藥的潛力。目前，利用植物提取物防治田七病害的報(bào)道較少。本研究以南艾蒿（Artemisia verlotorum Lamotte）為試驗(yàn)材料，測(cè)定了其乙醇提取物及其萃取物、乙酸乙酯相活性富集片段對(duì)田七根腐病原茄鐮孢（Fusarium solani）、田七黑斑病原人參鏈格孢（Alternaria panax）、田七炭疽病原膠孢炭疽菌（Colletotriehum gloeosporioides）3種田七病原菌的抑制作用，為防治田七病害提供農(nóng)藥用植物源。

1 材料與方法

1.1 材料

植物莖、葉采集于廣西德?？h足榮鄉(xiāng)，經(jīng)廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬仲輝博士鑒定為南艾蒿。PDA培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

試驗(yàn)菌株：田七根腐病病原茄鐮孢、田七黑斑病病原人參鏈格孢、田七炭疽病病原膠孢炭疽菌，均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)儀器：LRH-400-G光照培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、Laborota 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph儀器公司）、BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）、LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、DH27-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 南艾蒿乙醇提取物制備 選取無(wú)病害南艾蒿鮮莖、葉水洗后自然晾干，粉碎后取8.0 kg用8倍量乙醇于室溫下浸泡4 d，再用4層紗布過(guò)濾，得到濾液；濾渣用6倍量乙醇重復(fù)上一步浸泡操作，重復(fù)2次后，合并3次濾液；濾液減壓、濃縮后得浸膏（889 g）；稱(chēng)不同量的乙醇提取物浸膏，分別用無(wú)菌水定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為150、75、37.5 mg/mL的南艾蒿乙醇提取物溶液，于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2 南艾蒿乙醇提取物的萃取 取備用的南艾蒿乙醇提取物，加5倍量無(wú)菌水，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用有機(jī)溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次，各萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓、濃縮后得到石油醚相（144.3 g）、乙酸乙酯相（132.9 g）、正丁醇相（132 g）及水相4個(gè)部分的萃取相浸膏。稱(chēng)不同量的各萃取相浸膏，分別用無(wú)菌水定容至10 mL（乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏先用2 mL丙酮助溶），制得質(zhì)量濃度為150、75 mg/mL的分級(jí)萃取相溶液，4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.3 乙酸乙酯相活性富集片段的制備 乙酸乙酯相萃取物經(jīng)MCI柱，用甲醇水溶液梯度洗脫得到3個(gè)片段，F(xiàn)1（50%甲醇洗脫液）、F2（70%甲醇洗脫液）及F3（90%甲醇洗脫液），稱(chēng)適量的F1、F2及F3部分，蒸發(fā)、濃縮后分別用無(wú)菌水定容至10 mL（各部分先用2 mL的丙酮助溶），配制質(zhì)量濃度為150 mg/mL的乙酸乙酯萃取物活性化合物的富集溶液，于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.4 南艾蒿抑菌作用測(cè)定 以田七根腐病病原茄鐮孢、田七黑斑病病原人參鏈格孢、田七炭疽病病原膠孢炭疽菌為供試菌株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法[7]測(cè)定抑菌活性。

量取上述備用的乙醇提取物及其萃取物、乙酸乙酯相活性富集片段的不同質(zhì)量濃度的溶液1 mL，加入融化了的PDA培養(yǎng)基14 mL于90 mm培養(yǎng)皿中制成含藥平板，以等量的無(wú)菌水為對(duì)照（乙酸乙酯相、正丁醇相及乙酸乙酯相活性富集片段部分以丙酮含量為20%的等量無(wú)菌水為對(duì)照），待培養(yǎng)基凝固后，在預(yù)先培養(yǎng)的病原菌種中用打孔器打取直徑6 mm菌絲塊，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿的中央，每培養(yǎng)皿接種一塊，28 ℃培養(yǎng)，每個(gè)供試濃度重復(fù)3次。在第48、72、96 h采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取3次重復(fù)的平均結(jié)果，得到南艾蒿不同濃度提取物對(duì)供試菌的抑制效果。按如下公式計(jì)算抑菌率：

抑制率=[（對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量-處理菌落純生長(zhǎng)量）/對(duì)照菌落純生長(zhǎng)量]×100%

純生長(zhǎng)量=菌落平均直徑-菌餅直徑

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法 采用IBM SPSS Statistics for Mac 22進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 南艾蒿乙醇提取物對(duì)田七病原菌的抑制效果

不同濃度的南艾蒿乙醇提取物對(duì)田七3種病原菌的抑制作用見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，南艾蒿乙醇提取物對(duì)田七3種病原菌菌絲生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，其中對(duì)炭疽病病原菌生長(zhǎng)的抑制作用大于根腐病和黑斑病。隨著供試濃度的增加，其抑制率也增加。在培養(yǎng)48 h后，10 mg/mL的南艾蒿提取物對(duì)田七炭疽病、根腐病、黑斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)的最大抑制率分別為89.66%、74.42%和75.93%。但是南艾蒿乙醇提取物對(duì)炭疽病和黑斑病病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率表現(xiàn)出隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低的趨勢(shì)。

2.2 分極萃取物對(duì)田七病原菌的抑制效果

為了確認(rèn)南艾蒿抑菌活性成分的主要極性分布，用各相萃取物來(lái)測(cè)定抑制作用大小，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，在10 mg/mL供試濃度下培養(yǎng)48 h后，乙酸乙酯萃取物對(duì)炭疽病病原菌的抑制作用顯著大于石油醚萃取物、正丁醇萃取物及水相萃取物，最大抑制率達(dá)90.41%。對(duì)根腐病病原菌，乙酸乙酯萃取物抑制作用顯著大于其余三相萃取物，最大抑制率達(dá)到82.68%。對(duì)于黑斑病病原菌，乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物的抑制作用顯著大于另外兩相萃取物，其中乙酸乙酯萃取物抑制作用最大，抑制率達(dá)到71.79%，但水相萃取物對(duì)病原菌有顯著的促進(jìn)作用。含有20%丙酮的無(wú)菌水對(duì)田七3種病原菌的抑制作用不明顯。

2.3 乙酸乙酯相活性化合物的富集部分對(duì)田七病原菌的抑制效果

根據(jù)先前試驗(yàn)結(jié)果選用抑制作用最大的乙酸乙酯相萃取物進(jìn)一步確立活性富集段，由于其含有葉綠素等可能影響抑菌活性測(cè)定的物質(zhì)，故可利用MCI柱用甲醇水梯度洗脫去除葉綠素后再進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，結(jié)果（圖2）表現(xiàn)出在10 mg/mL質(zhì)量濃度下培養(yǎng)48 h后，F(xiàn)2段對(duì)田七3種病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到100%，顯著大于F1、F2段。

3 小結(jié)與討論

研究表明，艾蒿植株中的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、桉葉烷類(lèi)和三萜類(lèi)化合物[8]。江茂生等[9]測(cè)定出艾蒿提取物對(duì)供試植物病原菌具有不同程度的抑制活性，尤其對(duì)水稻紋枯病菌、十字花科菌核病菌、辣椒疫霉病菌、荔枝霜疫霉病菌、柑橘青霉病菌、紅麻灰霉病菌的菌絲生長(zhǎng)有較好抑制效果。田七是一種嚴(yán)格的陰生植物，在栽培過(guò)程中病害發(fā)生頻繁。在本試驗(yàn)中，南艾蒿乙醇提取物對(duì)田七3種病原真菌菌絲生長(zhǎng)均有很好的抑制作用，且隨著濃度的提高，抑制率呈上升趨勢(shì)，對(duì)炭疽病病原真菌的抑制效果最好。南艾蒿醇提取物中起抑制作用的活性成分主要分散于石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物中，其中乙酸乙酯段抑制效果更明顯。進(jìn)一步分離乙酸乙酯萃取物活性得到的富集片段F2，在10 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)田七3種病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率均達(dá)到100%，且在觀察中發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果不變。但若確定具體起作用的化合物活性成分，還需進(jìn)一步分離純化和活性檢測(cè)。本研究表明，南艾蒿中所含物質(zhì)對(duì)田七病原菌有較好的抑制作用，這與田間調(diào)查結(jié)果一致，這對(duì)田七及間套種藥材防治病害具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 劉 莉，劉大會(huì)，金 航，等.三七連作障礙的研究進(jìn)展[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2011，30（1）：70-75.

[3] 王秀玲，唐 蕊.植物源殺菌劑研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005， 44（2）：108-111.

[4] 李曉楠，楊紹斌.復(fù)合生物提取物對(duì)榆紫葉甲毒殺效果研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（8）：1815-1818.

[5] 徐亞軍.野生艾蒿乙醇浸提物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（9）：1786-1788.

[6] 江茂生，許文耀.艾蒿提取物對(duì)13種植物病原菌物的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，36（4）：352-356.

[7] 肖鳳艷，高郁芳.8種中藥提取物對(duì)薏苡灰霉病菌的抑制作用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51（9）：1784-1788.

[8] 周 峰，秦路平，連佳芳，等.艾葉的化學(xué)成分、生物活性和植物資源[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志，2000，18（2）：96-98.

[9] 江茂生，許文耀.艾蒿提取物對(duì)13種植物病原菌物的抑制作用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2007，36（4）：352-356.