摘要：asd-1基因編碼天冬氨酸半醛脫氫酶，該酶可影響革蘭氏陰性菌的細胞壁正常合成。為了研究嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）asd-1基因的功能，采用Overlap PCR方法敲除該基因，結果顯示asd-1基因的敲除明顯降低了嗜水氣單胞菌的生長速度，但是不會導致突變株對二氨基庚二酸（DAP）的強制需求，進一步對氨基酸序列分析表明asd-1蛋白質較遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌的asdA蛋白質多出3個氨基酸，其中Asn-257導致asdA蛋白質中的關鍵活性位點Arg-267在asd-1蛋白質中改變?yōu)閂al-267，該研究表明嗜水氣單胞菌的asd-1基因突變顯著降低其生長速度。

關鍵詞：嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；asd-1基因；生長速度；二氨基庚二酸（DAP）

中圖分類號：S941 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2667-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.054

Abstract：Aspartate β-semialdehyde deshydrogenase which participated in the cell wall synthesis was edcoded by asd-1 gene. In order to revealing the function of Aeromonas hydrophila asd-1 gene， this study deleted it by overlap PCR technology. The result showed that the bacteria growth rate decreased significantly when asd-1 gene deleted， but the obligate requirement for diaminopimelic acid（DAP） in asd-1 mutants was not changed. Amino acid sequencs alignment further showed that asd-1 protein had 370 amino acids， but the asdA protein of Edwardsiella tada and Edwardsiella ictalari just had 367 amino acids. The Asn-257 resulted the key site Arg-267 in asdA protein changed to Val-267 in asd-1 protein. It indicated that asd-1 gene mutant decreased the growth rate of Aeromonas hydrophila significantly.

Key words： Aeromonas hydrophila； asd-1 gene； growth rate； diaminopimelic acid（DAP）

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種在水樣環(huán)境中廣泛存在的細菌，該菌極易接觸動物，如魚、青蛙和人類等，到目前為止已經(jīng)從魚、食物、環(huán)境及臨床樣品中分離出該菌并且認為該菌是魚、爬蟲動物及人類的一種重要的病原菌，該病原常引起癤瘡病、潰瘍性結腸炎和細菌性敗血癥等疾病，具有發(fā)病魚種類多，流行范圍廣，多呈急性流行，發(fā)病后死亡率高的特點，在漁業(yè)養(yǎng)殖中由嗜水氣單胞菌引起的魚類死亡每年給全球帶來巨大的經(jīng)濟損失，同時嗜水氣單胞菌也是許多魚類疾病的共感菌[1-4]。

asd-1基因編碼天冬氨酸半醛脫氫酶（Asd；EC1.2.1.11），該酶是一種高度保守的同源二聚體酶，可將β-天冬氨酰磷酸轉換為β-半醛天冬氨酸鹽。同時天冬氨酸半醛脫氫酶也是賴氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和異亮氨酸等關鍵氨基酸生物合成的必需蛋白，同時它還在合成二氨基庚二酸（DAP）的反應中起關鍵作用，而DAP是革蘭氏陰性菌及部分革蘭氏陽性菌細胞壁成分肽聚糖的必需物質[5-7]。天冬氨酸半醛脫氫酶功能的缺失將導致細菌對DAP的強制性需求，否則細菌將裂解，在遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌、嗜肺軍團菌中已經(jīng)得到證實[8-10]，但在嗜水氣單胞菌的研究中尚未見相關報道。為了揭示asd-1基因在嗜水氣單胞菌中的功能，本研究通過Overlap PCR技術敲除asd-1基因以探討該基因的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用嗜水氣單胞菌AH-1菌株來自中國科學院水生生物研究所聶品實驗室，其他所用菌株及質粒為武漢市農(nóng)業(yè)科學技術研究院水產(chǎn)科學研究所魚病室保存，詳見表1。

試驗所用酶制劑來自TaKaRa公司，基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒購于天根生化科技有限公司，試驗所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR產(chǎn)物純化及DNA測序：采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒（金斯瑞生物科技有限公司）純化回收目的DNA片段，送金斯瑞生物科技有限公司測序，利用Blast程序進行序列比對。

1.2 嗜水氣單胞菌AH-1菌株asd-1基因的克隆

參照嗜水氣單胞菌ATCC 7966菌株的asd-1基因（NC_008570）序列設計引物asd1-checkF與asd1-checkR，詳見表2。以嗜水氣單胞菌AH-1菌株基因組為模板擴增asd-1基因序列，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上送至金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.3 嗜水氣單胞菌AH-1菌株asd-1基因缺失突變株的構建

通過等位基因交換的方式構建非極性突變[11]，正如之前所描述的那樣[12]，可概括為參照嗜水氣單胞菌ATCC 7966菌株的asd-1基因（NC_008570）上下游序列設計引物對asd1-for、asd1-int-rev和asd1-int-for、asd1-rev，詳見表2。以嗜水氣單胞菌AH-1菌株基因組為模板分別擴增asd-1基因上下游序列。以獲得的上下游片段混合物為模板，以asd1-for、asd1-rev為引物通過Overlap方法獲得缺失了asd-1基因的片段，將所獲得的片段連接入質粒pRE112獲得pRE112-△asd1轉化大腸桿菌MC1061 λ pir，將pRE112-△asd1轉入S17-1 λ pir用于與嗜水氣單胞菌進行結合轉移。突變株通過含有10%蔗糖的TSA培養(yǎng)基篩選。

1.4 嗜水氣單胞菌AH-1菌株asd-1基因突變株的性狀分析

突變菌株△asd1和野生菌株在TSB培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)過夜，連續(xù)10倍稀釋，轉接使終濃度大約為106 CFU/mL，28 ℃ 200 r/min培養(yǎng)，每隔1 h取樣測定OD540 nm，繪制生長曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad prism軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理，采用Two-way ANOVA檢測數(shù)據(jù)組之間的差異。

2 結果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌AH-1菌株asd-1基因的克隆及分析

測序獲得一段長度為1 498 bp DNA序列，該序列包含了長度為1 116 bp的asd-1基因，該基因序列已經(jīng)提交至NCBI，GenBank序列號為KR028357。bl2seq分析表明KR028357與NC_008570之間一致性為98%（圖1A）。將KR028357與NC_008570翻譯成蛋白質比較發(fā)現(xiàn)兩者之間僅有一個氨基酸的差異，即第181個氨基酸在菌株ATCC 7966中為亮氨酸（L），而在菌株AH-1中為蛋氨酸（M）（圖1B）。將KR028357翻譯成蛋白質與遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌的asdA蛋白質序列比對發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌的asd1蛋白質序列較asdA蛋白質序列多出3個氨基酸，其中Asn-257導致在遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌中的關鍵活性位點Arg-267在嗜水氣單胞菌的氨基酸改變?yōu)閂al-267，詳見圖2。

2.2 嗜水氣單胞菌AH-1菌株asd-1基因缺失突變株的構建

引物asd1-for、asd-int-rev擴增得到一段位于asd-1基因上游長度為417 bp的序列（圖3A），引物asd-int-for、asd1-rev擴增得到一段位于asd-1基因下游長度為652 bp的序列（圖3B）。以獲得的上下游片段混合物為模板，以asd1-for、asd1-rev為引物通過Overlap方法獲得缺失了asd-1基因的長度為1 069 bp的片段（圖3C）。在經(jīng)過2輪同源雙交換之后獲得了氯霉素敏感蔗糖耐受的突變株△asd1（圖3D）。

2.3 嗜水氣單胞菌突變株△asd1生長特性分析

生長曲線（圖4）表明，突變株△asd1的生長速度明顯慢于野生型菌株，Two-way ANOVA檢測數(shù)據(jù)組之間的差異為P<0.05，存在顯著差異。

3 小結與討論

天冬氨酸半醛脫氫酶是細胞壁合成反應中重要的一種蛋白質，該蛋白質功能的缺失將導致細胞壁合成障礙，在遲緩愛德華氏菌和鯰愛德華氏菌已經(jīng)得到證明[8，9]，本試驗克隆了嗜水氣單胞菌AH-1菌株的asd-1基因，該基因與公布的標準菌株ATCC 7966菌株asd-1基因在氨基酸序列上僅在第181位點存在差異，且該位點并非關鍵活性位點，因此從功能上推測該基因在嗜水氣單胞菌不同菌株間不存在差異。通過Overlap PCR敲除了asd-1基因，在敲除該asd-1基因之后發(fā)現(xiàn)雖然在生長速度上缺失突變株與野生型存在明顯差異，但是并未出現(xiàn)突變株對DAP底物強制需求的現(xiàn)象，遲緩愛德華氏菌和鯰愛德華氏菌的asdA基因功能研究表明其關鍵活性位點為Cys-135、Gln-162、Arg-267，通過與遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌asdA氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)，asd-1的氨基酸序列較遲緩愛德華氏菌、鯰愛德華氏菌asdA氨基酸序列多出3個氨基酸，其中多出的Asn-257導致關鍵活性位點Arg-267變成了Val-267，可能正是在關鍵酶活位點上的改變及Asn-257的存在導致了該蛋白質功能的變化。本研究表明嗜水氣單胞菌的asd-1基因并不直接影響細胞壁的合成，必然還有另外的基因和信號通路影響細胞壁的合成。

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