摘要：利用Genome walking方法在孟山都抗農(nóng)達(dá)油菜（Brassica napus L.）中克隆了GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將PCAMBIA-GOX-CP4EPSP植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜PolCMS恢復(fù)系“7-5”獲得轉(zhuǎn)基因植株。在田間對(duì)轉(zhuǎn)基因植株噴施400倍的農(nóng)達(dá)（41%草甘膦異丙胺鹽），所有的轉(zhuǎn)基因家系都能存活，而非轉(zhuǎn)基因PolCMS恢復(fù)系“7-5”全部死亡。在轉(zhuǎn)基因植株葉片中能夠檢測(cè)到GOX和CP4EPSP基因的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因T1代3個(gè)家系在60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上的發(fā)芽試驗(yàn)以及GUS染色分析表明抗草甘膦的單株能表達(dá)與GOX-CP4EPSP共轉(zhuǎn)化的GUS蛋白質(zhì)，而對(duì)草甘膦敏感的單株和野生型對(duì)照植株都不能表達(dá)GUS蛋白質(zhì)。鑒于GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋釉谵D(zhuǎn)基因油菜中的有效性和穩(wěn)定性，可以作為雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：油菜（Brassica napus L.）；GOX-CP4EPSP；雙順?lè)醋?；草甘膦抗性；農(nóng)達(dá)；篩選標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）10-2661-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.053

Abstract： GOX-CP4EPSP Two-Cistron structure from Monsanto Roundup resistant Brassica napus L. was cloned by Genome walking Transgenic PolCMS restore line “7-5” with plant binary transformation vector PCAMBIA-GOX-CP4EPSP survived better under 400 time diluted solution with commercial glyphosate-containing 41% herbicide， while non-transgenic plants“7-5” died sprayed with the same diluted solution. In transgenic plants leaves， GOX and CP4EPSP stably expressed. Three transgenic T1 plant lines germination and growth in 60 mg/L glyphosate medium and GUS staining detection indicate glyphosate resistant plants show stable GUS expression， however glyphosate sensitive plants have no GUS activity assessed histochemically in X-Gluc solution. Due to the efficiency in transgenic Brassica napus L.， the use of GOX-CP4EPSP structure as a selectable marker provides an effective and alternative transformation selection system for dicot species.

Key words： Brassica napus L.； GOX-CP4EPSP； two-cistron； glyphosate resistance； roundup； selective marker

草甘膦（N-phosphonomethyl-glycine，Glyphosate）是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜滅生性除草劑。1974年草甘膦作為除草劑在美國(guó)登記注冊(cè)之后，孟山都公司推出了草甘膦異丙胺鹽將其投放市場(chǎng)，商品名為農(nóng)達(dá)（Roundup）[1]。目前，草甘膦是世界上應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)藥品種[2-5]。

草甘膦被植物迅速吸收后隨著同化產(chǎn)物輸導(dǎo)到植物的整個(gè)器官中，對(duì)植物細(xì)胞分裂、葉綠素合成以及光合作用過(guò)程中的蛋白質(zhì)代謝有著重要影響并導(dǎo)致植物死亡。根據(jù)草甘膦的抑制作用原理[6，7]，能使植物具有草甘膦抗性的方法有過(guò)量表達(dá)植物內(nèi)源EPSP合酶；降解或者修飾解除草甘膦的抑制作用；在植物中轉(zhuǎn)化并表達(dá)外源EPSP合酶[8]。在細(xì)菌中，EPSPs是由aroA基因所編碼，大量抗草甘膦的aroA基因已被克隆，但只有少數(shù)基因被應(yīng)用于商業(yè)化轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物中[9-12]。目前抗草甘膦的作物大多數(shù)是轉(zhuǎn)入非敏感型的EPSP合酶基因，如從農(nóng)桿菌（Agrobacterium sp.CP4）中分離出的EPSP合成酶，它對(duì)PEP具有較高的親和性但對(duì)草甘膦不敏感，可以很好地替代植物內(nèi)源的EPSP合成酶系統(tǒng)，保證莽草酸途徑正常[13-15]。將CP4EPSP基因?qū)腌孀置?12使其產(chǎn)生對(duì)草甘膦的抗性，是由于CP4EPSP合成酶競(jìng)爭(zhēng)性與底物PEP結(jié)合從而產(chǎn)生草甘膦抗性[16]。對(duì)EPSP合酶基因?qū)崿F(xiàn)突變能創(chuàng)造新的耐草甘膦EPSPs。鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）中的aroA基因是草甘膦作用靶標(biāo)EPSP合成酶的編碼基因，該基因中單個(gè)核苷酸所造成的氨基酸的變化（Pro101Ser）會(huì)使其與底物PEP和草甘膦的親和性下降，但與后者的親和性下降得更多，從而產(chǎn)生對(duì)草甘膦的抗性[17]。對(duì)aroA基因的多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，以提高對(duì)PEP的親和力而降低對(duì)草甘膦的親和力可以優(yōu)化對(duì)草甘膦的抗性[18]。對(duì)草甘膦敏感的植物和細(xì)菌的EPSP合酶中100位置的氨基酸是保守的Gly，當(dāng)EPSP發(fā)生雙突變（T971，P101S）會(huì)引起Gly移碼到96位的草甘膦結(jié)合位點(diǎn)，從而產(chǎn)生草甘膦的耐受性[19]。水稻EPSP合酶基因出現(xiàn)P106L的突變能在大腸桿菌及轉(zhuǎn)基因煙草中提高對(duì)草甘膦的抗性[20]。玉米中兩個(gè)密碼子的改變能提高玉米對(duì)草甘膦的耐受性[21]。在牛筋草的EPSPS發(fā)生突變P106S，能提高5倍草甘膦的耐受性[22]。草甘膦氧化-還原酶GOX（Glyphosate oxidoreductase）是一類以草甘膦為靶標(biāo)的解毒抗性物質(zhì)，它存在于植物中對(duì)草甘膦的降解作用比較緩慢，細(xì)菌的GOX對(duì)草甘膦的降解速度快，但是不能單獨(dú)使用，所以和抗草甘膦的CP4共同使用。Barry等[23]從耐草甘膦的細(xì)菌中克隆了草甘膦氧化還原酶基因（GOX），該基因能夠?qū)⒉莞熟⒔到鉃榘奔谆姿帷OX基因和CP4EPSP基因轉(zhuǎn)化到小麥后得到了抗草甘膦的植株，并且GOX和CP4EPSP基因成為小麥遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中有效的篩選標(biāo)記[24]。

本研究通過(guò)對(duì)不同品種甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）進(jìn)行草甘膦的耐受性試驗(yàn)，確定在培養(yǎng)基上篩選油菜的合適濃度，根據(jù)Genome walking方法獲得具有抗性的GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋拥慕Y(jié)構(gòu)，將該結(jié)構(gòu)連接在植物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1301上，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜PolCMS優(yōu)良恢復(fù)系“7-5”，獲得抗農(nóng)達(dá)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因家系。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株葉片組織分析確定了抗性基因GOX和CP4EPSP都能夠穩(wěn)定表達(dá)，與GOX-CP4EPSP結(jié)構(gòu)共表達(dá)的GUS基因能夠在草甘膦抗性培養(yǎng)基篩選到的陽(yáng)性植株中穩(wěn)定表達(dá)，表明GOX-CP4EPSP表達(dá)能作為油菜遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、組培激素和除草劑 油菜優(yōu)良的PolCMS恢復(fù)系材料“7-5”和“7492”來(lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜育種研究室?？共莞熟⒌挠筒藖?lái)自于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜育種研究室以孟山都公司抗農(nóng)達(dá)轉(zhuǎn)基因油菜作為供體親本，“6179”為輪回親本經(jīng)過(guò)多年回交以及抗性鑒定的抗草甘膦油菜。油菜組織培養(yǎng)中的激素2，4-D，6-芐基嘌呤和玉米素均購(gòu)自Sigma公司。組培中使用篩選劑草甘膦（glyphosate）購(gòu)自Sigma公司（P9556：N-磷?；谆?甘氨酸），組培篩選濃度60 mg/L。組培中使用的潮霉素（HPT）購(gòu)自Roche公司，篩選濃度20 mg/L。人工溫室中噴施油菜的是稀釋400倍的農(nóng)達(dá)（41%草甘膦異丙胺鹽）。

1.1.2 主要載體及試劑 植物表達(dá)的雙元轉(zhuǎn)化載體為pCAMBIA1301載體，Taq酶購(gòu)自Fermentas公司，TA克隆試劑盒pGEM-T購(gòu)自Promega公司，膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，Genome WalkerTM Universal Kit為Clontech產(chǎn)品，感受態(tài)細(xì)胞宿主菌E. coil DH5α。GUS染色液的配制：100 mg Gluc，先溶于1 mL的DMF。取80 mL 50 mmoL/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0），加入1 mL 50 mmol/L鐵氰化鉀、 1 mL 50 mmol/L亞鐵氰化鉀和2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），再加入已溶解的Gluc，再加20 mL的甲醇混勻。將配好的GUS檢測(cè)液分裝于1.5 mL的離心管中（1 mL/管，1組1管），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 引物 引物合成和測(cè)序來(lái)自北京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同甘藍(lán)型油菜在草甘膦培養(yǎng)基上發(fā)芽試驗(yàn) 將甘藍(lán)型油菜“7-5”，“7492”分別在添加了3種濃度40、60和80 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察在不同濃度草甘膦處理后的發(fā)芽情況。

1.2.2 GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋拥目寺?將轉(zhuǎn)育得到的抗草甘膦油菜材料構(gòu)建基因組文庫(kù)，具體步驟參考洪登峰[25]。以構(gòu)建好的文庫(kù)為模板，分別對(duì)GOX和CP4EPSP 2個(gè)元件的5′端和3′端進(jìn)行兩輪PCR-Walking反應(yīng)，引物見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序，序列拼接后在NCBI-Blast網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)序列，獲得雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)中完整的P-FMV、CTPI、GOX、E9 3′terminator、CTP2和CP4EPSP組分的序列。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè) 取植株的葉片按照CTAB小樣法提取總DNA。雙順?lè)醋又袠?biāo)記基因的特異引物GOX-F和GOX-R，EPSP-F和EPSP-R。半定量PCR檢測(cè)試驗(yàn)中內(nèi)參引物Actin-F和Actin-R。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.0 μL，dNTPs （10 mmol/L）0.15 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.0 μL，Primer-F（10 μmol/L）0.2 μL，Primer-R（10 μmol/L）0.2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，油菜總DNA模板（50 ng/μL）2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，混合均勻后加礦物油覆蓋。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.4 油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng) 油菜種子消毒后置于發(fā)芽培養(yǎng)基MS+20 g/L 蔗糖+0.8% 瓊脂，暗培養(yǎng)7 d。將切成0.5 cm的油菜下胚軸置于預(yù)培養(yǎng)基MS+30 g/L 蔗糖+0.8%瓊脂 +1 mg/L 2，4-D，培養(yǎng)3 d。取活化好的含有植物雙元轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌（OD600 nm=0.1）侵染外植體，將侵染后的外植體轉(zhuǎn)移到鋪上濾紙的共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d。將外植體轉(zhuǎn)移到脫菌培養(yǎng)基MS+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂+1 mg/L 2，4-D+250 mg/L羧芐青霉素二鈉+10 mg/L潮霉素或者60 mg/L草甘膦，培養(yǎng)7 d。轉(zhuǎn)移外植體到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基MS+4 mg/L 6-芐基嘌呤+2 mg/L 玉米素+30 g/L 蔗糖+0.8%瓊脂+250 mg/L羧芐青霉素二鈉+10 mg/L潮霉素或者60 mg/L 草甘膦+5 mg/L AgNO3培養(yǎng)2～3周，待外植體兩端愈傷膨大后轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)出芽培養(yǎng)基MS+3 mg/L 6-芐基嘌呤+2 mg/L玉米素+30 g/L蔗糖+0.8%瓊脂+250 mg/L羧芐青霉素二鈉+10 mg/L潮霉素或者60 mg/L草甘膦上直到出芽。

1.2.5 草甘膦篩選培養(yǎng)基上油菜苗的GUS檢測(cè) 將轉(zhuǎn)基因油菜T1代以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏姆N子置于60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基發(fā)芽，10 d后將培養(yǎng)基上的油菜苗放入X-Gluc染色液中37 ℃暗反應(yīng)16 h，之后在76%乙醇中脫色1 d，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜對(duì)不同濃度草甘膦的耐受性研究

將甘藍(lán)型油菜“7-5”和“7492”在40、60和80 mg/L草甘膦的培養(yǎng)基上發(fā)芽。隨著草甘膦濃度的增加，“7-5”和“7492”的根系生長(zhǎng)受到抑制，主要表現(xiàn)為根毛不能正常伸展（圖1）。在40 mg/L草甘膦培養(yǎng)基中“7-5”和“7492”有20%單株的根毛能夠繼續(xù)伸長(zhǎng)，而在60、80 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上100%單株的根毛不能正常伸展，因此，將60 mg/L草甘膦濃度定義為轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜發(fā)芽試驗(yàn)中篩選濃度。

2.2 GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋拥目寺?/p>

利用GOX和CP4EPSP元件的特異引物在轉(zhuǎn)育得到的抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因油菜材料中擴(kuò)增出部分GOX和CP4EPSP元件的序列。根據(jù)所獲得的序列設(shè)計(jì)Genome walking反應(yīng)的引物，利用巢式PCR分別擴(kuò)增GOX元件以及CP4EPSP元件的上游和下游的序列，拼接后進(jìn)行Blast比對(duì)，最后確定完整的FMV啟動(dòng)子、葉綠體定位信號(hào)肽CTP、GOX基因編碼區(qū)、CP4EPSP基因編碼區(qū)以及Pea E9的3’terminator的序列（圖2）。

2.3 GOX-CP4EPSP轉(zhuǎn)化油菜的轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定

將克隆得到的GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)連接到植物表達(dá)載體PCAMBIA1301中，獲得GOX-CP4EPSP表達(dá)載體，并將pCAMBIA1301-GOX-CP4EPSP轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜“7-5”中。對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)基因T1代3個(gè)家系的植株進(jìn)行分子鑒定確定陽(yáng)性單株，在人工溫室中對(duì)野生型非轉(zhuǎn)基因植株和T1代轉(zhuǎn)基因植株噴施農(nóng)達(dá)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株都表現(xiàn)對(duì)農(nóng)達(dá)的抗性（圖3A、圖3B）。T1代轉(zhuǎn)基因植株在添加不同濃度的草甘膦培養(yǎng)基上發(fā)芽，結(jié)果顯示隨著草甘膦濃度的增加T1代種子正常發(fā)芽后能夠生長(zhǎng)成幼苗，而非轉(zhuǎn)基因植株在添加不同濃度草甘膦的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制（圖3C）。對(duì)T1代抗性植株自交后獲得的T2代種子在60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上發(fā)芽。相比非轉(zhuǎn)基因材料，轉(zhuǎn)基因植株種子能夠正常萌發(fā)并且根系發(fā)育正常，根毛舒展（圖3D）。

2.4 GOX和CP4EPSP基因在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦植株中的表達(dá)分析

如圖4A所示，在4個(gè)轉(zhuǎn)基因T2代家系植株的葉片中都能夠檢測(cè)到GOX和CP4EPSP基因的表達(dá)。在人工溫室中對(duì)轉(zhuǎn)基因家系和非轉(zhuǎn)基因材料噴施稀釋400倍的農(nóng)達(dá)，相比非轉(zhuǎn)基因材料，所有的轉(zhuǎn)基因單株表現(xiàn)出對(duì)農(nóng)達(dá)的抗性（圖4B）。

2.5 利用GOX-CP4EPSP作為轉(zhuǎn)基因材料篩選標(biāo)記

將轉(zhuǎn)基因T1代3個(gè)家系GB6、GD16、GE3和非轉(zhuǎn)基因的種子在60 mg/L草甘膦的培養(yǎng)基上發(fā)芽，其中GB6T1和GE3T1家系在培養(yǎng)基上能夠正常生長(zhǎng)，而GD16T1在培養(yǎng)基上有少數(shù)單株和非轉(zhuǎn)基因油菜苗表現(xiàn)一致，它們的根系生長(zhǎng)都受到嚴(yán)重抑制（圖5A箭頭所指）。pCAMBIA1301-GOX-CP4EPSP載體上含有GUS基因，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦油菜單株中GUS基因能夠與GOX-EPSP雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)共表達(dá)。選取GB6T1、GE3T1和GD16T1家系中抗草甘膦的單株、非轉(zhuǎn)基因材料以及GD16T1在篩選培養(yǎng)基上表現(xiàn)對(duì)草甘膦敏感的植株置于X-Gluc染色液中染色。如圖5B所示，只有在草甘膦篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因油菜才能檢測(cè)到GUS蛋白質(zhì)的表達(dá)，而根系生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制的油菜苗中檢測(cè)不到GUS蛋白質(zhì)表達(dá)。為避免植物內(nèi)源組織染色產(chǎn)生的假陽(yáng)性，對(duì)GD16家系在篩選培養(yǎng)基中具有抗性和敏感的單株取樣，檢測(cè)GUS基因。由表2可以看出，所有能夠在60 mg/L草甘膦培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因單株都能檢測(cè)到GUS基因以及GUS蛋白質(zhì)的表達(dá)，而不能繼續(xù)生長(zhǎng)的植株中檢測(cè)不到GUS蛋白質(zhì)的表達(dá)，因此GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)是油菜在草甘膦篩選培養(yǎng)過(guò)程中的有效篩選標(biāo)記基因。

3 討論

農(nóng)達(dá)是當(dāng)今世界上銷售量最大并且使用最為廣泛的除草劑品種。EPSP合成酶催化phosphoenolpyruvate（PEP）轉(zhuǎn)化為S3P，早在1980年，研究者們就獲得了對(duì)草甘膦不敏感的EPSP合酶應(yīng)用到作物抗除草劑的育種中。隨后在微生物中通過(guò)對(duì)EPSP合酶的位點(diǎn)特異性突變尋找到新的抗性突變，但是隨著突變后的EPSP合酶對(duì)草甘膦抗性的增強(qiáng)也同時(shí)會(huì)表現(xiàn)出對(duì)PEP的親和性下降從而影響催化活性。本試驗(yàn)中所利用的CP4-EPSP合酶基因是因?yàn)樵诨钚晕稽c(diǎn)中有一個(gè)殘基（Ala-100）使其具有對(duì)草甘膦的抗性。而在自然界的植物和細(xì)菌中EPSP酶的此活性位點(diǎn)是Gly殘基。在一定濃度的草甘膦持久處理下可能會(huì)產(chǎn)生既能夠降低草甘膦活性也能保持穩(wěn)定催化效率的突變位點(diǎn)。至今為止從細(xì)菌中獲得了有效的抗草甘膦的EPSP合酶突變位點(diǎn)，而在植物中所得到抗除草劑的突變EPSP合酶基因用于抗除草劑應(yīng)用的很少，這可能是因?yàn)樘烊豢共莞熟⑿禄虻漠a(chǎn)生依賴于細(xì)菌或者植株組織的繁殖代數(shù)以及基因復(fù)制的穩(wěn)定性。相比細(xì)菌，大多數(shù)植物的生育期長(zhǎng)并且基因復(fù)制過(guò)程受到嚴(yán)格調(diào)控，不易得到天然的抗草甘膦突變體。另外前人研究認(rèn)為EPSP合酶是病原菌以及害蟲(chóng)的靶酶，而草甘膦只具有微弱的抗真菌的作用，對(duì)EPSP合酶與草甘膦以及其余抑制劑結(jié)合的模式研究中可以設(shè)計(jì)出新型抗病蟲(chóng)的除草劑抗性基因。

本研究利用孟山都公司轉(zhuǎn)基因抗農(nóng)達(dá)的油菜中克隆到GOX-CP4EPSP的雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)，并利用遺傳轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜PolCMS恢復(fù)系“7-5”中。轉(zhuǎn)基因T1代以及T2代都表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗性。相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)育的方法來(lái)獲得抗農(nóng)達(dá)的油菜，這種方法可以有效地避免轉(zhuǎn)育過(guò)程中的遺傳背景對(duì)受體材料的影響，通過(guò)一次轉(zhuǎn)基因事件獲得抗農(nóng)達(dá)的油菜省時(shí)省力。另外將轉(zhuǎn)基因T1代油菜和非轉(zhuǎn)基因材料在60 mg/L草甘膦的濃度下篩選后獲得了能夠正常生長(zhǎng)的植株，在這些植株中都能夠檢測(cè)到共表達(dá)的GUS蛋白質(zhì)的活性，而受到嚴(yán)重抑制的植株中檢測(cè)不到GUS蛋白質(zhì)的表達(dá)。草甘膦具有能夠在植株分生組織中快速積累并有效抑制非轉(zhuǎn)化植株的特性，表明GOX-CP4EPSP雙順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)的表達(dá)能夠成為油菜轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的篩選標(biāo)記基因。

隨著轉(zhuǎn)基因抗農(nóng)達(dá)植物的廣泛種植，農(nóng)達(dá)的長(zhǎng)期而大量地使用所帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題引起研究者的關(guān)注。雜草種群內(nèi)存在著大量遺傳變異如基因突變、種內(nèi)異花授粉會(huì)增加雜草的抗藥性，另外較強(qiáng)的除草劑選擇壓會(huì)篩選出抗藥遺傳類型的雜草群體，它們的除草劑靶基因序列或者表達(dá)發(fā)生改變導(dǎo)致與除草劑結(jié)合能力下降或者靶標(biāo)酶濃度增加使得除草劑不能與其飽和[26-28]。在實(shí)際應(yīng)用中可以在植物雙元轉(zhuǎn)化載體中引入兩種或者多種除草劑抗性基因，這樣可以通過(guò)一次轉(zhuǎn)基因事件高效獲得能抗多種不同原理除草劑的油菜新材料，在田間輪流使用不同類型的除草劑，合理搭配速效性除草劑和遲效性除草劑，延長(zhǎng)除草劑的有效期，發(fā)揮其最大的防治效果可以有效避免雜草的耐藥性。

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