摘要：利用秋水仙素，采用浸泡法和固體培養(yǎng)法分別對黃花蒿（Artemisia annua L.）叢生芽進行多倍體誘導(dǎo)，以期獲得黃花蒿多倍體種質(zhì)。結(jié)果表明，以5 000 mg/L秋水仙素浸泡叢生芽5 d處理獲得的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率可達40 %。對性狀變異明顯的黃花蒿植株進行染色體數(shù)目觀察，發(fā)現(xiàn)了黃花蒿四倍體和嵌合體。

關(guān)鍵詞：黃花蒿（Artemisia annua L.）；多倍體誘導(dǎo)；組織培養(yǎng)；秋水仙素；染色體鑒定

中圖分類號：S567.23+9.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）10-2591-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.035

Abstract： In order to obtain new polyploid germplasm of Artemisia annua L.， immersing and solid culture method with colchicines were used for polyploidy induction. The results showed that the buds immersed in 5 000 mg/L colchicine for 5 d had the highest polyploidy induction rate as 40%. Tetraploid and chimera plants were found by observing the chromosome numbers of A. annua polyploid plants with obvious phenotypic variances

Key words： Artemisia annua L.； polyploidy induction； tissue culture； colchicine； chromosome identification

黃花蒿（Artemisia annua L.）又名青蒿、臭蒿、香蒿、苦蒿，為菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia L.）一年生草本植物， 是傳統(tǒng)中藥，具有清熱解暑，除蒸，截瘧的功效，早在公元340年東晉醫(yī)藥學(xué)家葛洪《肘后備急方》中就有記載。黃花蒿作為重要的藥用植物，是一種寶貴的生物資源，其分布極其廣泛，是世界廣布種，但世界上青蒿素類藥物的原料80%～90%來自中國。黃花蒿中的主要成分青蒿素是一種具有過氧橋基的倍半萜內(nèi)酯[1]，有速效和低副作用的抗瘧性能[2]，是中國惟一進入美國藥典（USP）、并作為國際惟一注冊銷售的源于傳統(tǒng)中藥且具有中國知識產(chǎn)權(quán)和國際專利的重要天然藥品，同時也是被WHO推薦的首選基本目錄藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹性瘧疾有很好的療效[3]。黃花蒿基因型較為豐富，在自然條件下相對比較難以實現(xiàn)優(yōu)良基因資源的人工保存及其繁殖利用[4]；而組織培養(yǎng)技術(shù)則可以克服以上問題。利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體育種技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種植物上，如黃蟬蘭[5]、桔梗[6]、甜葉菊[7]、雞蛋參[8]等。國內(nèi)外有關(guān)黃花蒿多倍體研究已有少許報道[9-11]，并取得了相似的試驗結(jié)果，這表明在離體條件下利用秋水仙素誘導(dǎo)黃花蒿多倍體具有可行性，但未見生產(chǎn)應(yīng)用的報道。試驗以黃花蒿為材料，結(jié)合已有的黃花蒿組織培養(yǎng)技術(shù)[12-15]，通過秋水仙素誘導(dǎo)黃花蒿多倍體種質(zhì)進行多倍體培養(yǎng)，以期為黃花蒿良種繁育工作提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗以廣西藥用植物園科研基地種植的黃花蒿幼嫩枝條為供試活體材料。化學(xué)試劑主要有MS培養(yǎng)基（自配）、HgCl2、NaClO、6-BA（6-芐基氨基嘌呤）、NAA（萘乙酸）、秋水仙素、KT（6-糠氨基嘌呤）、IBA（吲哚丁酸）、高錳酸鉀、甲醛、乙醇、對二氯苯、α-溴萘、卡諾固定液、苯酚品紅、HCl、醋酸等。儀器主要有無菌接種箱、培養(yǎng)搖床、培養(yǎng)箱、冰箱、水浴鍋、徠卡DM2500型雙目生物顯微鏡、照相機等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件均為溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間12 h/d、相對空氣濕度75%～85%。不定期用70%乙醇噴霧殺菌降塵，并定期用高錳酸鉀和甲醛混合液對培養(yǎng)室進行密閉熏蒸消毒。

1.2.2 叢生芽培養(yǎng) 采用黃花蒿枝條中上部的嫩莖，用中性洗滌劑洗涮后，流水漂洗30 min，吸干水分，用0.05%升汞（HgCl2）滅菌5 min，再用飽和次氯酸鈉（NaClO）滅菌15 min，然后用無菌水沖洗5次，切成1.5 cm 左右的莖段，接種于MS+0.05 mg/L的6-BA+0.01 mg/L的NAA培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)叢生芽。

1.2.3 多倍體的誘導(dǎo) ①浸泡法。將分化程度基本一致的黃花蒿叢生芽浸泡于濃度分別為500、1 000、2 500、5 000 mg/L的經(jīng)過濾膜滅菌的無菌秋水仙素溶液中，并置于搖床上分別振蕩培養(yǎng)2、3、4、5 d，轉(zhuǎn)速為100 r/min。以不加秋水仙素溶液的材料為對照（也是分別振蕩培養(yǎng)2、3、4、5 d），共20個處理。每個處理10個材料，重復(fù)3次。處理后用無菌水反復(fù)沖洗3～5次，并接種于MS基本培養(yǎng)基上。10 d后，將處理后仍成活的試管苗編號建立株系，接種于MS+1.0 mg/L的6-BA+0.2 mg/L的NAA+0.5 mg/L的KT繼代增殖培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，30 d后進行觀察統(tǒng)計。②固體培養(yǎng)法。將分化程度基本一致的黃花蒿叢生芽接種于含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L秋水仙素的MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，以不加秋水仙素的材料為對照，共11個處理，每個處理30個材料，重復(fù)3次。將處理后仍成活的試管苗編號建立株系，用無菌水反復(fù)沖洗3～5次，并接種于MS+1.0 mg/L的6-BA+0.2 mg/L的NAA+0.5 mg/L的KT繼代增殖培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，30 d后進行觀察統(tǒng)計。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將浸泡法和固體培養(yǎng)法獲得的各株系接種于MS+0.05 mg/L的IBA生根培養(yǎng)基上進行20 d生根培養(yǎng)，以誘導(dǎo)根系發(fā)生。

1.2.5 根尖染色體鑒定 常規(guī)制片，待生根苗根長至1.5～3.0 cm長時，于上午9：00～12：00的5個時段，分別在9：25、9：55、10：25、10：55和11：50各取性狀明顯有變異的黃花蒿根尖組織。①預(yù)處理，將約0.5 cm長的根尖組織放入飽和對二氯苯溶液中并置于4 ℃冰箱中整體處理5～6 h或放入α-溴萘中置于4 ℃冰箱中整體處理24 h，以積累分裂中期的細(xì)胞。然后用無菌水水洗，接著用預(yù)冷的卡諾固定液固定24 h后，置于70%乙醇中洗滌3～5次，并保存。②染色與壓片：將保存于70%乙醇中的材料取出置于50%乙醇中3～5 min過渡，用無菌水沖洗3～4次后，在1 mol HCl中置于60 ℃水浴鍋中恒溫解離5～10 min，用無菌水沖洗至少10 min后，放入45%醋酸中軟化5～10 min，然后用刀片將解離材料的根尖部分切下，置于載玻片上，加一小滴改良苯酚品紅染色液，用鑷子和解剖針將解離材料打成懸浮液，再加一小滴改良苯酚品紅染色液，染色5 min后壓片。③鏡檢：將做好的切片放于雙目生物顯微鏡下觀察染色體分散情況，記錄并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素浸泡法誘導(dǎo)黃花蒿叢生芽多倍體

秋水仙素不同濃度溶液浸泡和不同處理時間對黃花蒿叢生芽誘導(dǎo)變異的影響情況見表1。由表1可以看出，秋水仙素對黃花蒿叢生芽的毒害程度與浸泡時間密切相關(guān)，隨著處理時間的延長，試管苗叢生芽存活率降低，但其誘導(dǎo)率隨之提高。秋水仙素濃度為0～500 mg/L時，黃花蒿的誘導(dǎo)率為0，為無效濃度。在1 000 mg/L秋水仙素處理4 d后，黃花蒿開始有變異現(xiàn)象出現(xiàn)。當(dāng)秋水仙濃度提高到2 500 mg/L和5 000mg/L、處理4～5 d時，誘導(dǎo)率相對提高，但同時死亡率也相對增加。試驗結(jié)果表明，用秋水仙素浸泡黃花蒿叢生芽，處理濃度為2 500 mg/L和5 000 mg/L、處理時間達到4～5 d時，誘導(dǎo)效果相對較好，其中以5 000 mg/L秋水仙素處理5 d的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率可達40%。

2.2 秋水仙素固體培養(yǎng)法誘導(dǎo)黃花蒿叢生芽多倍體

秋水仙素不同濃度加入到固體培養(yǎng)基后對黃花蒿叢生芽誘導(dǎo)變異的影響情況見表2。由表2可以看出，培養(yǎng)基中加入秋水仙素的處理，黃花蒿叢生芽均有變異產(chǎn)生。當(dāng)培養(yǎng)基附加的秋水仙素濃度達到70 mg/L時，誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率為13.33%；當(dāng)秋水仙素濃度為100 mg/L時，黃花蒿的死亡率達到了76.67%，且出現(xiàn)了嵌合體。說明固體培養(yǎng)基添加秋水仙素后，當(dāng)處理濃度為70 mg/L時，誘導(dǎo)效果較好，且死亡率相對較低。

2.3 生根培養(yǎng)

由MS+0.05 mg/L的IBA生根培養(yǎng)基經(jīng)20 d生根培養(yǎng)后，固體培養(yǎng)基添加秋水仙素的處理僅有少量生根，而經(jīng)秋水仙素浸泡法培養(yǎng)的黃花蒿叢生芽相對較易生根。

2.4 染色體鑒定結(jié)果

2.4.1 取材最佳時間 不同時間取材壓片鏡檢的結(jié)果顯示，在上午10∶25取材，用飽和對二氯苯預(yù)處理并置于4 ℃冰箱中6 h或者用α-溴萘預(yù)處理后置于4 ℃冰箱中整體處理24 h，解離8～9 min，解離后用45%的冰醋酸對材料進行處理可以達到較好的制片效果。

2.4.2 壓片鏡檢的結(jié)果 隨機取20株（浸泡法和固體培養(yǎng)法各10株）性狀變異明顯的黃花蒿材料進行染色體數(shù)目觀察，以二倍體黃花蒿材料為對照。結(jié)果表明，黃花蒿二倍體染色體數(shù)目為2n=2x=18（圖1），四倍體染色體數(shù)目為2n=4x=36（圖2）。與二倍體相比，四倍體植物較為粗壯，葉片濃綠，變大（圖3）。另外在固體培養(yǎng)法得到的部分性狀明顯變異植株中，同一根尖中發(fā)現(xiàn)了18條和36條染色體2種細(xì)胞并存的現(xiàn)象，初步判斷其為嵌合體。

3 小結(jié)與討論

試驗以黃花蒿叢生芽為誘導(dǎo)材料，采用秋水仙素浸泡后培養(yǎng)、固體培養(yǎng)基添加秋水仙素相結(jié)合的誘導(dǎo)技術(shù)，探索黃花蒿多倍體誘導(dǎo)的有關(guān)參數(shù)，篩選出了組織培養(yǎng)誘導(dǎo)黃花蒿多倍體的最佳方法，即以5 000 mg/L秋水仙素浸泡叢生芽5 d的處理獲得的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率可達40%，并成功獲得了黃花蒿四倍體材料，為選育抗逆性強、產(chǎn)量高、青蒿素含量多的黃花蒿優(yōu)質(zhì)新品種提供了可行路徑。

穆勝玉[11]報道的浸泡法雖然可以誘導(dǎo)得到多倍體，但發(fā)現(xiàn)該方法容易使材料缺氧，且對材料傷害比較直接。本試驗在浸泡的基礎(chǔ)上，使用了搖床進行振蕩處理，增加材料與氧氣接觸的空間，以減少對材料的傷害，獲得了較好的誘導(dǎo)效果。同時發(fā)現(xiàn)隨著秋水仙素濃度的增加，黃花蒿多倍體誘導(dǎo)率隨之提高，但其死亡率隨之增加。固體培養(yǎng)法由于參試材料沒有完全接觸到秋水仙素，容易出現(xiàn)嵌合體；隨著秋水仙素濃度的增加，黃花蒿死亡率也隨之增加，這可能是間接導(dǎo)致誘導(dǎo)率隨之降低的原因之一。

藥用植物大多以根、莖和葉等器官為收獲對象，其染色體加倍后，根、莖、葉巨型化，能大幅度提高以相應(yīng)部位入藥的藥材產(chǎn)量，較好地滿足了藥材生產(chǎn)的要求；藥用植物的倍性變化往往能導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物含量的變化，多倍體植株通常具有較高含量的活性成分，大多數(shù)多倍體中次生代謝產(chǎn)物的含量都有所增加，這就有可能獲得有效成分含量高的藥用植物新品種[16，17]。尋曉紅等[9]和穆勝玉[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃花蒿四倍體植株的營養(yǎng)體和花蕾比二倍體明顯增大、增重，Jesus等[10]研究發(fā)現(xiàn)，四倍體的青蒿素含量比二倍體高很多，所以通過秋水仙素誘導(dǎo)黃花蒿四倍體可能將為選育抗逆性強、產(chǎn)量高、青蒿素含量多的黃花蒿優(yōu)質(zhì)新品種提供了一條新途徑。

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