摘要：為了解荸薺[Heleocharis dulcis （Burm. f.）Trin. ex Hensch.]花粉生活力和最佳體外萌發(fā)條件，分別采用I2-KI、TTC、MTT染色法和離體培養(yǎng)基萌發(fā)法對(duì)荸薺花粉活力進(jìn)行了測(cè)定，并初步研究了荸薺花粉在常溫（25 ℃）條件和低溫（4 ℃）貯藏條件下活力變化的動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，MTT染色法測(cè)定結(jié)果與離體萌發(fā)法最接近，最適宜荸薺花粉活力的快速檢測(cè)；離體萌發(fā)法適宜培養(yǎng)基配方為1%蔗糖+50 μg/mL硼酸；荸薺花粉在常溫條件下50 min活力降至0.29%的低水平，在低溫條件下5 h后完全失去活力。

關(guān)鍵詞：荸薺[Heleocharis dulcis（Burm. f.） Trin. ex Hensch.]；花粉活力；測(cè)定方法；貯藏壽命

中圖分類號(hào)：S645.3+42 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）10-2564-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.028

Abstracts： To study the pollen viability and in vitro germination conditions of Heleocharis dulcis（Burm. f.） Trin. ex Hensch.， viability of H. dulcis pollen was determined by three testing staining methods including I2-KI， TTC， MTT and in vitro culture method. Dynamic changes of in vitro pollen germination rate under the storage condition of 25 ℃ and 4 ℃ was compared. The result indicated that the pollen dyed rate of MTT staining method was similar to the in vitro germination rate， thus the MTT staining method is suitable for fast test of the pollen viability of H. dulcis. The best medium for in vitro pollen germination of H. dulcis was 1% sucrose + 50 μg/mL boric acid. The in vitro pollen germination rate of H. dulcis decreased to 0.29% when stored at 25 ℃ for 50 min， while decreased to 0 when stored at 4 ℃ for 5 h.

Key words： Heleocharis dulcis （Burm. f.）Trin. ex Hensch.； pollen viability； determination method； storage life

荸薺[Heleocharis dulcis（Burm. f.）Trin. ex Hensch.]為莎草科（Cyperaceae）荸薺屬（Heleocharis R. Br.）多年生草本植物，其以球莖供食用，生食、熟食皆宜，是一種重要的水生蔬菜之一。目前，中國(guó)荸薺栽培面積約為3.5萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量75萬(wàn)t左右[1]，荸薺栽培對(duì)于農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效發(fā)揮了重要作用。國(guó)內(nèi)各地荸薺產(chǎn)區(qū)栽培的荸薺品種多為地方品種，鮮見(jiàn)有荸薺選育品種；荸薺育種多利用自然變異采用單株系選的方法進(jìn)行，或者利用荸薺組織培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的變異經(jīng)單株選育而成，育種方法單一。開展荸薺人工雜交育種研究已成為業(yè)內(nèi)共識(shí)，但相關(guān)報(bào)道較少。荸薺花粉活力高低對(duì)雜交育種成敗和效率有著重要的影響，在荸薺雜交前進(jìn)行荸薺花粉活力測(cè)定和花粉貯藏壽命調(diào)查，可有效提高雜交效率。目前尚未見(jiàn)荸薺花粉測(cè)定方法和花粉保存壽命研究的報(bào)道，為此課題組開展了荸薺花粉活力測(cè)定方法比較試驗(yàn)，同時(shí)觀察和分析荸薺花粉在離體室溫（25 ℃）和低溫（4 ℃）條件下的活力變化規(guī)律，以期為荸薺雜交育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

荸薺花粉采集于湖北地方品種沙洋荸薺，在早晨8：00采集花藥完全伸出小花、但尚未散粉的花序若干，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用鑷子捏取荸薺花序中部花藥1個(gè)，置于載玻片上靜置20 min，用于花粉活力測(cè)定方法試驗(yàn)；花粉壽命測(cè)定試驗(yàn)取樣方法同此。

1.2 花粉活力測(cè)定

1.2.1 培養(yǎng)基發(fā)芽法 液體培養(yǎng)基參照胡適宜[2]提出的配方，經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)初步確定蔗糖和硼酸的濃度范圍，按照表1組合配制9個(gè)液體培養(yǎng)基處理。將載玻片花藥加1～2滴液體培養(yǎng)基，用鑷子輕搗，花粉散于培養(yǎng)基液體后夾出花藥，置室溫下1 h后，顯微鏡下觀察3個(gè)視野，凡是出現(xiàn)花粉管伸出即認(rèn)為發(fā)芽。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。

1.2.2 I2-KI染色法 于載玻片花藥加1～2滴I2-KI溶液（將0.3 g碘和1.3 g碘化鉀溶解于100 mL去離子水中）[3]，用鑷子輕搗使花粉散出，夾出花藥后蓋上載玻片，置于35 ℃恒溫箱中30 min，然后在顯微鏡下觀察不同的3個(gè)視野，凡是染成藍(lán)色者為有活力的花粉。觀察3個(gè)制片（重復(fù)3次），統(tǒng)計(jì)平均染色率。

1.2.3 TTC染色法 于載玻片花藥加1～2滴0.5% TTC溶液（稱取0.5 g TTC，加入少許95%乙醇使其溶解后，用去離子水稀釋至100 mL）[4]，用鑷子輕搗使花粉散出，夾出花藥后蓋上載玻片，置于35 ℃恒溫箱中30 min，然后在顯微鏡下觀察不同的3個(gè)視野，凡是染成紅色者為有活力的花粉。觀察3個(gè)制片（重復(fù)3次），統(tǒng)計(jì)平均染色率。

1.2.4 MTT染色法 于載玻片花藥加1～2滴1% MTT溶液（稱取0.1 g MTT，溶解于10 mL配制好的5%蔗糖溶液中）[5]，用鑷子輕搗使花粉散出，夾出花藥，其風(fēng)干后再?gòu)?fù)滴1滴，待再次風(fēng)干后置顯微鏡下觀察不同的3個(gè)視野，凡是花粉粒邊緣變黑、中心變玫紅色者為有活力的花粉。觀察3個(gè)制片（重復(fù)3次），統(tǒng)計(jì)平均染色率。

1.3 花粉壽命測(cè)定

設(shè)置常溫（25 ℃）離體貯藏和低溫（4 ℃）離體貯藏試驗(yàn)。取田間采回后的樣品分為2份，1份置室溫，另1份置4 ℃冰箱保存，每隔固定時(shí)間（常溫離體壽命試驗(yàn)間隔10 min，低溫離體壽命試驗(yàn)間隔1 h），用鑷子取荸薺花序中部花藥2個(gè)，置于載玻片上，加1～2滴上述篩選出的液體培養(yǎng)基，置室溫下1 h后，顯微鏡下觀察3個(gè)視野，凡是出現(xiàn)花粉管伸出即認(rèn)為發(fā)芽，觀察3個(gè)制片（重復(fù)3次）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均取平均值，統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 10.5軟件處理、制表、作圖，并進(jìn)行方差分析；利用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法（Duncan's new multiple range test，DMRT）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉活力檢測(cè)情況

在液體培養(yǎng)基花粉發(fā)芽試驗(yàn)中，對(duì)觀察到的部分花粉粒花粉管伸出、呈乳突狀或者更長(zhǎng)者記為有活力，不同配方液體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下荸薺花粉發(fā)芽率方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，蔗糖因子和區(qū)組間差異顯著（P<0.05），而硼酸因子與組合間差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明蔗糖含量是影響荸薺花粉萌發(fā)的主要影響因子，而且在預(yù)備試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)高含量的蔗糖（10%～20%）會(huì)使荸薺花粉基本不萌發(fā)，所以初步認(rèn)為荸薺花粉萌發(fā)需要低含量的蔗糖，一般1%～5%；進(jìn)一步的多重比較結(jié)果見(jiàn)表3，從表3可看出，蔗糖含量為1%、硼酸濃度50 μg/mL的組合處理發(fā)芽率最高，達(dá)24.07%，與蔗糖濃度1%、硼酸含量25 μg/mL的處理間差異不顯著（P>0.05），但顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）高于其他處理。

3種染色法測(cè)定的花粉活力情況見(jiàn)表4。由表4可以看出，I2-KI染色法在顯微鏡下的花粉粒分別呈現(xiàn)出藍(lán)色和金黃色，花粉粒呈現(xiàn)藍(lán)色的比率約為48.3%；TTC染色法在顯微鏡下的花粉粒均現(xiàn)淡黃色，并未出現(xiàn)紅色，初步認(rèn)為該方法不適合荸薺花粉的活力檢測(cè)；MTT染色法部分花粉粒則呈現(xiàn)玫紅色、淡紅色以及透明無(wú)色，而且邊緣現(xiàn)藍(lán)黑色圈，經(jīng)過(guò)觀察計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，呈現(xiàn)玫紅色的花粉粒染色率達(dá)28.3%，一般認(rèn)為染色顏色越深花粉活力越強(qiáng)，淡紅色、透明無(wú)色視為活力弱或無(wú)活力。

2.2 花粉壽命比較

2.2.1 常溫離體條件下荸薺花粉活力 常溫（25 ℃）離體條件下不同貯藏時(shí)間對(duì)荸薺花粉發(fā)芽率的影響情況見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，荸薺花粉在常溫離體條件下其發(fā)芽率在前20 min內(nèi)由14.45%下降到4.79%，下降幅度較大，而后逐漸緩慢降低；50 min后其活力僅為0.29%。由此看來(lái)，荸薺在常溫離體條件下，其花粉壽命約在50～60 min，在 30 min內(nèi)花粉能保持較高的活力。

2.2.2 低溫離體條件下荸薺花粉活力 低溫（4 ℃）離體條件下不同貯藏時(shí)間對(duì)荸薺花粉發(fā)芽率的影響情況見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，在低溫（4 ℃）離體條件下，荸薺花粉發(fā)芽率在前1 h迅速下降，由10.91%下降到6.07%，降幅近50%；之后的2 h內(nèi)下降緩慢；在貯藏3 h后又迅速下降，至5 h時(shí)荸薺花粉已完全失去活力。由此可以看出，荸薺花粉在低溫（4 ℃）離體條件下，其最長(zhǎng)貯藏壽命為5 h，3 h以內(nèi)則荸薺花粉能夠保持較高的活力。

3 小結(jié)與討論

實(shí)驗(yàn)室花粉活力測(cè)定方法主要有染色法和離體萌發(fā)法；染色法是最簡(jiǎn)便、最快捷、最易操作的一種測(cè)定方式，但由于不同作物的花粉自身特性（如花粉壁的厚薄、花粉外壁的組成物質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)含量、質(zhì)膜完整性、花粉內(nèi)各種酶活性的強(qiáng)弱等）不同，不同染色方法測(cè)定花粉活力的準(zhǔn)確性差異較大；而離體萌發(fā)法測(cè)定花粉活力最直觀、最準(zhǔn)確。試驗(yàn)以離體萌發(fā)法測(cè)定的結(jié)果為對(duì)照，比較了I2-KI、TTC和MTT染色法應(yīng)用于荸薺花粉活力的適用性，結(jié)果表明，I2-KI雖能夠使荸薺花粉染成藍(lán)色，但測(cè)定結(jié)果較離體萌發(fā)法高出1倍以上，部分含有淀粉而無(wú)活力的花粉亦被染成藍(lán)色，所以采用該方法測(cè)定的荸薺花粉活力誤差較大。TTC染色法將花粉染成顏色很淡的黃色，不易區(qū)分染色花粉粒與無(wú)色花粉粒，筆者認(rèn)為該方法不適用于荸薺花粉活力的測(cè)定。MTT染色法能夠很清晰染色，并且可區(qū)分花粉活力強(qiáng)弱的染色深淺，測(cè)定的結(jié)果亦與離體萌發(fā)法結(jié)果最接近，因此筆者認(rèn)為MTT染色法最適合荸薺花粉活力的測(cè)定。在花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)中，蔗糖起著維持花粉與培養(yǎng)基之間滲透平衡的作用，也是花粉萌發(fā)的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)和能量來(lái)源，不同植物花粉萌發(fā)的適宜蔗糖濃度有所不同，一般為5%～15%[6]，但通過(guò)此次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荸薺花粉萌發(fā)宜采用1%的低蔗糖濃度。硼酸的作用是促進(jìn)花粉管的萌發(fā)，不同的植物在濃度上差別也較大[7-10]，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硼酸可明顯促進(jìn)荸薺花粉萌發(fā)，濃度宜為50 μg/mL。

試驗(yàn)結(jié)果表明，荸薺花粉保持活力的時(shí)間較短，其在常溫條件下50 min時(shí)活力僅為0.29%；即使在低溫條件下，在前3 h內(nèi)可保持較高活力，而在貯藏5 h后完全失去活力。因此筆者認(rèn)為，荸薺雜交人工授粉時(shí)宜在采集到花粉后20 min內(nèi)進(jìn)行；若花粉在低溫貯藏條件下，則應(yīng)在3 h內(nèi)進(jìn)行授粉?；ǚ圪A藏條件與溫度、濕度和光照等因素相關(guān)，但試驗(yàn)僅研究了荸薺花粉在4 ℃低溫條件下的貯藏壽命長(zhǎng)短，而且在此條件下的貯藏壽命尚不能達(dá)到異地授粉或者花期不遇親本授粉的要求，因此還有待進(jìn)一步開展荸薺花粉超低溫、不同濕度和光照條件下貯藏壽命長(zhǎng)短的研究，以期延長(zhǎng)其貯藏壽命。

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