摘要：采用組織分離法對(duì)枯死的百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）鱗莖進(jìn)行病原分離，根據(jù)分離物的培養(yǎng)性狀、顏色、孢子大小，結(jié)合顯微鏡檢測(cè)和分子生物學(xué)ITS序列測(cè)定，該菌株被鑒定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。對(duì)菌株進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，證明尖孢鐮刀菌是導(dǎo)致百合枯萎病的病原菌。選擇15種殺菌劑對(duì)該病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果表明，廣清、綠群、洛菌腈、氟硅唑抑菌效果明顯強(qiáng)于其他藥劑。

關(guān)鍵詞：百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；ITS序列；室內(nèi)毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S436.46 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）10-2551-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.025

Abstract：The pathogen was obtained from infected bulblets of Lilium brownii and was determined as Fusarium oxysporum according to its culture characters， colors， spore size. Microscope and ITS molecular marker were also used to determine whether F. oxysporum caused blight of L. brownii identified via Koch′s postulation. The indoor toxicity test of 15 fungicides were researched. The results showed that phenazine-1-carboxylic acid，fludioxonil and flusilazole had better inhibitory effect than other fungicides.

Key words： Lilium brownii var. viridulum Baker； Fusarium oxysporum； ITS sequence； indoor toxicity

萬載有500多年食用百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）種植的歷史，是中國(guó)三大百合基地之一。2006年萬載百合種植被列為“國(guó)家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)”，龍牙百合被評(píng)為“江西省名牌農(nóng)產(chǎn)品”。但由于栽培品種長(zhǎng)期無性繁殖，種性嚴(yán)重退化，枯萎病大面積發(fā)生，如何防治百合枯萎病是目前急需解決的問題。

引起百合枯萎病的病原菌主要有尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、串珠鐮刀菌（F. rnoniliforme）和茄腐皮鐮刀菌（F. solani）。鄒一平等[1]報(bào)道了龍牙百合枯萎病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌和茄腐皮鐮刀菌。李誠(chéng)等[2]、馮昱人等[3]報(bào)道蘭州百合枯萎病病原為尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌（F. rnoniliforme）和茄腐皮鐮刀菌，主要致病菌是尖孢鐮刀菌。楊秀梅等[4]報(bào)道了云南百合枯萎病病原為尖孢鐮刀菌，并進(jìn)行了ITS序列分析。在病害防治方面，目前國(guó)內(nèi)報(bào)道防治百合枯萎病的殺菌劑主要包括多菌靈、噁霉靈、烯唑醇、中生菌素等，筆者在百合栽培大田試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多菌靈、噁霉靈、中生菌素等藥劑防治百合枯萎病效果較差，亟須篩選出新型、安全、高效的防治藥劑。為了進(jìn)一步查明萬載百合枯萎病病原菌，并篩選出更適宜的殺菌劑，特進(jìn)行本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

從江西省萬載縣白水鄉(xiāng)百合基地采集枯萎病龍牙百合鱗球，采用PDA培養(yǎng)分離、提純病原菌。對(duì)15種藥劑進(jìn)行室內(nèi)抑菌試驗(yàn)，供試藥劑見表1。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離和純化 病原物的分離參照文獻(xiàn)[5]和[6]的方法進(jìn)行。病原物的純化，主要通過切取菌絲段或挑取單孢進(jìn)行純培養(yǎng)，純化后的菌種轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上保存。

1.2.2 分離病原菌的鑒定 培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)觀察，根據(jù)分離真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況和孢子顯微形態(tài)進(jìn)行鑒定。

病原菌的分子生物學(xué)鑒定，采用真菌核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增病原菌并測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站，用BLAST軟件與GenBank中已知種屬的rDNA進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析。病原菌ITS全序列分析委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。

1.2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證 根據(jù)柯赫氏法則，將健康百合鱗片接種至長(zhǎng)滿菌絲的草炭、珍珠巖的混合基質(zhì)內(nèi)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，選取出現(xiàn)相同癥狀的鱗片進(jìn)行病原菌的再次分離鑒定。

1.2.4 殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定 在預(yù)備試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)百合枯萎病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率在5%～95%范圍內(nèi)的不同殺菌劑；每種藥劑分別取不同的濃度，在18 mL PDA培養(yǎng)基（55 ℃）中加入2 mL藥劑，分別倒入3個(gè)直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)（3次重復(fù)），靜置30 min后在平板中央放5 mm的菌餅，于25 ℃下倒置培養(yǎng)，對(duì)照處理的菌絲生長(zhǎng)直徑大于50 mm后，量取各平板中菌落的直徑，以加入滅菌水的培養(yǎng)基平板為對(duì)照，計(jì)算抑菌率。將抑菌率換算成機(jī)率值、藥劑濃度換算成對(duì)數(shù)值進(jìn)行計(jì)算[7，8]；利用SPSS 19.0軟件求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50，并對(duì)常用藥劑濃度下的抑菌率進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

從百合病株中分離得到絲狀真菌，菌株之間形態(tài)差異較大，氣生菌絲白色、粉色至紫色，絲絨狀、羊毛狀或氈狀，培養(yǎng)基表面無色或淡紫色，菌落背面粉色或紫色。小型分生孢子0～1分隔，卵圓形或腎形，假頭生，5.0～17.5 μm×2.0～5.0 μm。大型分生孢子紡錘形或稍彎，較勻稱，具2～5個(gè)隔膜，22.5～40.0 μm×2.5～6.0 μm（圖1、圖2）。

2.2 病原菌rDNA-ITS序列分析

為進(jìn)一步確定分離得到的病原菌是否為尖孢鐮刀菌，從分離到的菌株中隨機(jī)抽取菌株，克隆并分析了該菌的rDNA-ITS序列。菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、測(cè)序，該序列全長(zhǎng)為566 bp。將菌株的核糖體DNA-ITS基因在Genbank中進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的100個(gè)ITS序列菌株全部為茄腐皮鐮刀菌屬菌（AB470903.1、EF152426.1、AJ608989.1、KP132235.1、AB470904.1、KJ680136.1、AB518683.1），與它們的同源性為99%。菌株核糖體DNA-ITS序列與尖孢鐮刀菌（DQ452447.1）的同源性為99%。結(jié)合培養(yǎng)性狀等形態(tài)學(xué)特征和ITS區(qū)域的DNA序列分析，證明所分離到的菌株為尖孢鐮刀菌[9]（圖3、圖4）。

2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證結(jié)果

用純化的菌株回接健康的百合鱗片，表現(xiàn)出相同的腐爛癥狀。從感病百合鱗片上再分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，鏡檢后觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子，故判斷引起萬載百合枯萎病的病原菌就是尖孢鐮刀菌。

2.4 殺菌劑的室內(nèi)篩選結(jié)果

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果（表2）表明，10種藥劑對(duì)尖孢鐮刀菌均有一定的抑制作用，且隨濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，其相關(guān)系數(shù)均在0.900以上。但不同藥劑之間的抑制作用差異較大，其中氟硅唑抑制作用最強(qiáng)，EC50為2.226 mg/L；其次是綠群，EC50為3.140 mg/L；再次是適樂時(shí)，EC50為4.015 mg/L；氟嗎·唑菌酯的效果最差，EC50為2 324.538 mg/L。其余5種參試藥劑因試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)系數(shù)過低，故未列入表中。

對(duì)參試15種殺菌劑常用濃度進(jìn)行抑菌率試驗(yàn)，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果（表3）表明，廣清、綠群抑菌率顯著高于其他參試藥劑；廣清、綠群、洛菌腈和唑醚·代森聯(lián)抑菌率極顯著高于其他參試藥劑，抑菌率分別為96.57%、94.34%、84.71%、84.56%、79.84%；腈苯唑和苯甲·嘧菌酯抑菌率大于60%，極顯著高于諾德·苗斯達(dá)、多菌靈、氰霜唑、中生菌素、啶氧菌酯、氟嗎·唑菌酯、烯唑醇和噁霉靈；諾德·苗斯達(dá)、多菌靈、氰霜唑、中生菌素、啶氧菌酯、氟嗎·唑菌酯、烯唑醇和噁霉靈抑菌率均小于60%。

3 小結(jié)與討論

多菌靈、噁霉靈、中生菌素用于防治鐮刀菌引起的百合枯萎病有良好的防效[7，10，11]。但本試驗(yàn)使用上述殺菌劑防治效果不佳。

申嗪霉素（廣清、綠群）作為一種新型微生物源綠色農(nóng)藥對(duì)鐮刀菌引起的西瓜枯萎病、番茄枯萎病有很好的防效[12，13]。本試驗(yàn)表明，其室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果與前人研究類似，對(duì)鐮刀菌引起的百合枯萎病也具有優(yōu)異的防效。

三唑類殺菌劑是一類重要的內(nèi)吸性殺菌劑，烯唑醇[7]、丙環(huán)唑[14]等對(duì)鐮刀菌引起的百合枯萎病具有良好的防效。本試驗(yàn)選用氟硅唑、腈苯唑進(jìn)行試驗(yàn)，其藥效顯著優(yōu)于烯唑醇，為百合枯萎病的有效防治增添了新的三唑類殺菌劑。

目前，適樂時(shí)懸浮種衣劑在百合生產(chǎn)上主要用作種球處理[15]，也用于黃瓜枯萎病[14]、西瓜枯萎病[16]防治，具有良好的防效，本試驗(yàn)證明其室內(nèi)抑制枯萎病菌藥效優(yōu)異。

試驗(yàn)采用毒力回歸方程和方差分析兩種方法進(jìn)行試驗(yàn)分析，能較好地發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)。采用EC50較好體現(xiàn)了抑菌率為50%時(shí)參試藥劑的劑量，通過用藥量的多少進(jìn)行藥效判斷，但當(dāng)參試藥劑藥效較差時(shí)，可能會(huì)使部分藥液濃度的抑菌率均很低，從而不利于生成回歸方程；利用方差分析方法、采用常用藥劑濃度進(jìn)行抑菌率試驗(yàn)，能比較各參試農(nóng)藥抑菌率差異。二者結(jié)合應(yīng)用，較好地比較了多菌靈、噁霉靈、中生菌素等藥劑的抑菌率。

本研究以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征為基礎(chǔ)，對(duì)百合枯萎病菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行分析和比對(duì)，從分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步明確萬載百合種植基地百合枯萎病的病原菌為尖孢鐮刀菌。選用15種殺菌劑對(duì)該病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，篩選出適宜藥劑，為該病的田間防治和抗性品種選育提供理論依據(jù)。氟硅唑、廣清、綠群、苯甲·嘧菌酯、唑醚·代森聯(lián)、適樂時(shí)、腈苯唑防治百合枯萎病為首次報(bào)道。

致謝：百合枯萎病病原菌菌種鑒定得到宜春學(xué)院鄒一平教授的指導(dǎo)，特此致謝。

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