摘要：采取共提取法提取土壤微生物總RNA后，經(jīng)過(guò)去DNA、過(guò)柱純化等手段，利用Poly（A）聚合酶在純化RNA末端添加Poly（A）尾，將產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，用細(xì)菌16S rDNA引物和nosZ（氧化亞氮還原酶基因）引物擴(kuò)增目的片段。結(jié)果表明：利用此方法能夠獲得帶有Poly（A）尾的土壤原核微生物核糖體RNA和mRNA，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一次轉(zhuǎn)錄后，可用于擴(kuò)增土壤微生物目的基因。此方法相對(duì)于利用目的基因特異下游引物來(lái)作為逆轉(zhuǎn)錄引物獲得cDNA更加方便，用于研究土壤原核微生物多個(gè)基因的表達(dá)特征時(shí)，此方法十分實(shí)用。

關(guān)鍵詞：土壤；微生物；RNA；加Poly（A）尾；逆轉(zhuǎn)錄

中圖分類號(hào)：Q752 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2016）02-0001-04

目前，以土壤微生物DNA為基礎(chǔ)探究土壤微生物多樣性與土壤生物性質(zhì)的研究已有較多報(bào)道，例如以16S rDNA為基礎(chǔ)的分析[1-4]和以功能基因DNA為基礎(chǔ)的分析[5-7]。然而，土壤微生物基因表達(dá)與其在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的功能關(guān)系更密切，但是通過(guò)土壤微生物基因表達(dá)來(lái)研究土壤環(huán)境中的微生物與土壤生態(tài)過(guò)程的報(bào)道不多[8-10]。主要是存在以下幾方面的原因：（1）土壤等環(huán)境樣品中RNA 酶含量豐富，RNA易被降解，提取完整的RNA比較困難；（2）土壤RNA提取物含有腐殖酸等雜質(zhì)，影響后續(xù)RNA操作，如逆轉(zhuǎn)錄等；（3）土壤原核微生物RNA結(jié)構(gòu)不像真核生物一樣帶有Poly（A）尾，利用商業(yè)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒無(wú)法一次性獲得所有基因的cDNA第一鏈；這些給研究土壤微生物功能基因的表達(dá)帶來(lái)挑戰(zhàn)。

關(guān)于土壤微生物RNA的提取和純化，課題組已取得了一些研究進(jìn)展[11]。目前，研究環(huán)境微生物功能基因的表達(dá)時(shí)主要采用功能基因特異引物[9]或隨機(jī)引物[12-13]作為逆轉(zhuǎn)錄的引物。采用功能基因特異引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物時(shí)，一次轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物只能研究一個(gè)功能基因，當(dāng)要同時(shí)研究多個(gè)相關(guān)基因時(shí)，必須用不同的特異引物做若干次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。六堿基或十堿基隨機(jī)引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物在理論上是可以獲得全部轉(zhuǎn)錄信息的，但是在現(xiàn)實(shí)中往往難以獲得較長(zhǎng)的片斷，并且所獲得的轉(zhuǎn)錄片斷大小不一。而利用oligo（dT） 作為引物，能夠?qū)в蠵oly（A）尾的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，然而絕大多數(shù)原核微生物mRNA缺少Poly（A）尾。Botero等[14]曾利用Poly（A）聚合酶在16S rRNA末端加A，成功構(gòu)建了16S rRNA基因的cDNA文庫(kù)。現(xiàn)階段，在土壤原核微生物mRNA上加Poly（A）尾的報(bào)道較少見(jiàn)。筆者利用水稻土壤微生物總RNA，試圖在原核微生物總RNA的3’端加poly（A）尾，擬解決土壤微生物RNA逆轉(zhuǎn)錄中存在的問(wèn)題，為研究土壤微生物功能基因表達(dá)與微生物生態(tài)功能之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土 壤 土壤取自中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所桃園試驗(yàn)站水稻長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田，地處東經(jīng)111°27'、北緯28°55'，海拔高89 m。土壤為第四紀(jì)紅土發(fā)育的青隔黃泥。采集深度0～15 cm，按五點(diǎn)法采樣，混合后立即用液氮冷凍，于-70℃保存。

1.1.2 主要試劑 DNase核酸酶（Promega）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）、Taq DNA聚合酶（天根生化）、RNA純化試劑盒（天根生化科技有限公司）、Poly（A）聚合酶（Ambion）。

1.1.3 引 物 由GenBank檢索的微生物16S rDNA

的序列和nosZ（氧化亞氮還原酶）基因序列保守區(qū)段

設(shè)計(jì)特異引物。引物如下：16S rDNA上游5’-CGGTG

AATACGTTCYCGG-3’，下游5’-GGWTACCTTGT

TACGACT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度123 bp[15]。nosZ上游

5’-WCSYTGTTCMTCGACAGCCAG-3’，下游5’-ATG

TCGATCARCTGVKCRTTYTC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度259 bp[16]。其中，R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，V=A/C/G。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤微生物RNA的提取 土壤微生物RNA提?。海?）稱取2 g土樣和2 g玻璃珠置于預(yù)冷研缽中；（2）倒入液氮，研磨5 min，研磨過(guò)程中應(yīng)避免液氮完全揮發(fā)；（3）將研磨樣品放入50 mL離心管中，加入10 mL提取液[包含100 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH值7.0）、100 mmol/L Tris-HCl（pH值7.0）、100 mmol/L EDTA（pH值8.0）、1.5 mol/L NaCl、1%CTAB（pH值8.0）和2%SDS（pH值7.2）]，65℃水浴30 min，每隔10 min搖動(dòng)一次；（4）4℃下3 000 r/min離心10 min；（5）將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入20 mL預(yù)冷的氯仿/異戊醇（V︰V=24︰1）；（6）為了獲得更多樣品，土樣再加入5 mL提取液，混勻，65℃水浴10 min，重復(fù)（4）、（5）的步驟；（7）取上清液與氯仿/異戊醇混勻，4℃下3 000 r/min離心20 min；（8）將水相移至另一離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇室溫沉淀30 min；（9）室溫下16 000 r/min離心20 min；（10）沉淀在無(wú)菌臺(tái)稍微干燥，加入100 μL DEPC進(jìn)行溶解[17]。

1.2.2 RNA純化 采用Nanodrop測(cè)定RNA溶液的濃度，并用1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。利用RQ1 RNase-free DNase（Promega）去除提取液中的DNA。按照以下順序加入反應(yīng)底物和各種反應(yīng)液：10 μL RNase-Free DNase 10× Reaction Buffer，20 μL RNA，60 μL Nuclease–free water，10 μL RNase-Free DNase。37℃溫水浴0.5 h，然后向反應(yīng)體系中加入10 μL DNase終止反應(yīng)液，65℃溫水浴10 min。將上一步獲得的反應(yīng)液用RNAclean RNA純化試劑盒過(guò)柱純化。最后溶于30 μL DEPC處理水中。取10 μL純化以后的RNA樣品，通過(guò)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性。利用16S rDNA和nosZ基因的特異引物，以純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)樣品中是否有痕量的基因組DNA殘留。

1.2.3 加A反應(yīng) 在室溫下，按照以下順序加入反應(yīng)底物和各種反應(yīng)液：22 μL純化的RNA樣品，8 μL 5×E-PAP Buffer，4 μL 25 mmol/L MnCl2，4 μL 10 mmol/L rATP，2 μL E-PAP，反應(yīng)體系加無(wú)菌水到40 μL。37℃溫水浴1 h，然后冰上放置或者保存在-20℃。采用Nanodrop測(cè)定RNA溶液的濃度。取15 μL反應(yīng)液電泳，觀察RNA加A后的條帶特征。

1.2.4 RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)模板和引物差異設(shè)置 3個(gè)處理。處理1：以 RNA加A產(chǎn)物為模板，利用oligo（dT） 為引物，合成cDNA第一鏈。處理2：以純化RNA為模板，利用oligo（dT）為引物，合成cDNA第一鏈。處理3：以純化RNA為模板，分別利用16S rDNA和nosZ基因下游引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物，合成cDNA第一鏈。cDNA第一鏈合成后PCR擴(kuò)增16S rDNA和nosZ。反應(yīng)體系：10×PCR bufer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Taq酶1 U，cDNA 2 μL，補(bǔ)無(wú)菌水至總體積25 μL。16S rDNA擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。nosZ基因擴(kuò)增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物RNA提取與純化

土壤微生物RNA提取后，脫氧核糖核酸和核糖核酸的濃度大約在100～137 ng/μL，電泳結(jié)果判斷RNA未發(fā)生嚴(yán)重降解，見(jiàn)圖1。根據(jù)1 U/μg DNA 的比率加入DNase 5 U，RNA提取物20 μL，降解提取物中的DNA，降解反應(yīng)體系為100 μL。將反應(yīng)液全部純化，獲得30 μL回收液體。取8 μL純化回收液電泳，RNA條帶沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)圖1。 取1 μL回收液做模板分別擴(kuò)增16S rDNA和nosZ，均不能擴(kuò)增到目的條帶，擴(kuò)增結(jié)果表明純化的RNA中不存在基因組DNA，見(jiàn)圖2和圖3。

2.2 加A反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄、RT-PCR

取純化的RNA，加入加Poly（A）反應(yīng)試劑，獲得加A產(chǎn)物40 μL，取15 μL電泳，發(fā)現(xiàn)RNA條帶發(fā)生了明顯的變化，16S和23S之間出現(xiàn)了彌散，并且23S以上也出現(xiàn)了彌散，見(jiàn)圖4。

Nanodrop測(cè)定RNA溶液的濃度為382 ng/μL。利用處理1獲得的cDNA第一鏈為模板分別擴(kuò)增得到16S rDNA和nosZ基因，這說(shuō)明土壤微生物16S

rRNA和mRNA在大腸桿菌Poly（A）聚合酶作用下體外加上Poly（A）尾。而利用處理2獲得的cDNA第一鏈為模板，未能擴(kuò)增到16S rDNA 和nosZ基因，以處理3獲得的cDNA第一鏈為模板，能擴(kuò)增到16S rDNA 和nosZ基因，見(jiàn)圖5和圖6。

純化后的RNA要逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，可以選擇不同的方法。由于大多數(shù)原核生物mRNA的3’端沒(méi)有多聚A尾，所以不能直接利用oligo（dT）引物，這也是處理2不能擴(kuò)增到16S rDNA 和nosZ基因的原因。而以功能基因的特異下游引物為合成cDNA第一鏈的引物時(shí)，卻可以擴(kuò)增出特異條帶，如處理3。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)過(guò)程中提取的土壤微生物RNA經(jīng)DNA酶處理后，未能檢測(cè)到DNA殘留，純化后的RNA經(jīng)過(guò)加A反應(yīng)，其條帶發(fā)生了顯著變化，這主要是因?yàn)榇竽c桿菌Poly（A）聚合酶能夠在RNA末端加上150～600個(gè)堿基，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是大腸桿菌Poly（A）聚合酶催化了加A反應(yīng)。

利用Poly（A）聚合酶將RNA加A尾后再逆轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能用于多個(gè)原核微生物功能基因的研究，避免了用不同基因特異引物轉(zhuǎn)錄帶來(lái)的試驗(yàn)誤差，有利于方便準(zhǔn)確了解各功能基因的表達(dá)。當(dāng)研究一種環(huán)境微生物功能基因的表達(dá)情況時(shí)，采用特異引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物相對(duì)便利[18]，但當(dāng)需要同時(shí)研究環(huán)境微生物多個(gè)基因的表達(dá)時(shí)，如果采用特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，那么需要逆轉(zhuǎn)錄多次[9]，大大降低試驗(yàn)的精度。由于關(guān)注環(huán)境微生物功能基因表達(dá)的研究較少[18-19]，所以對(duì)于如何提高這一方面研究效率的報(bào)道就更少了[14]。

由于土壤微生物RNA提取過(guò)后，提取液中還有一些抑制酶活性的成分，如腐植酸和多酚類物質(zhì)，這些成分將影響酶的活性，直接影響加A反應(yīng)和合成cDNA反應(yīng)的順利進(jìn)行，所以試驗(yàn)過(guò)程中RNA需要高度純化才能進(jìn)行下一步酶學(xué)反應(yīng)[20]。Botero等利用切膠技術(shù)回收土壤的16S rRNA片段，獲得環(huán)境微生物的核糖體RNA文庫(kù)，然而要獲得土壤微生物功能基因的相關(guān)信息，切膠回收手段存在一定的困難。因?yàn)楣δ芑虻钠伍L(zhǎng)度不一，并且豐度相對(duì)于16S rRNA而言極低，切膠回收會(huì)導(dǎo)致部分功能基因mRNA丟失，所以該研究選擇過(guò)柱的方式純化RNA。

土壤微生物總RNA的純化加A產(chǎn)物能以O(shè)ligo（dT）為逆轉(zhuǎn)錄引物獲得cDNA第一鏈。這一結(jié)果為探索環(huán)境微生物轉(zhuǎn)錄組學(xué)過(guò)程中快速獲得原核微生物所有功能基因的表達(dá)提供了一個(gè)新的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ward D M，Weller R，Bateson M M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community[J]. Nature，1990，345（6270）：63-65.

[2] Cheneby D，Philippot L，Hartmann A，et al. 16S rDNA analysis for characterization of denitrifying bacteria isolated from three agricultural soils[J]. Fems Microbiology Ecology，2000，34（2）：121-128.

[3] Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

[4] Mummey D L，Stahl P D. Spatial and temporal variability of bacterial 16S rDNA-based T-RFLP patterns derived from soil of two Wyoming grassland ecosystems[J]. Fems Microbiology Ecology，2003，46（1）：113-120.

[5] Roesch C，Mergel A，Bothe H. Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（8）：3818-3829.

[6] Scala D J，Kerkhof L J. Diversity of nitrous oxide reductase（nosZ） genes in continental shelf sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（4）：1681-1687.

[7] Magalhaes C，Bano N，Wiebe W J，et al. Dynamics of nitrous oxide reductase genes（nosZ） in intertidal rocky biofilms and sediments of the douro river estuary（Portugal），and their relation to N-biogeochemistry [J]. Microbial Ecology，2008，55（2）：259-269.

[8] Poretsky R S，Bano N，Buchan A，et al. Analysis of microbial gene transcripts in environmental samples[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（7）：4121-4126.

[9] Nogales B，Timmis K N，Nedwell D B，et al. Detection and diversity of expressed denitrification genes in estuarine sediments after reverse transcription-PCR amplification from mRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（10）：5017-5025.

[10] Bulow S E，F(xiàn)rancis C A，Jackson G A，et al. Sediment denitrifier community composition and nirS gene expression investigated with functional gene microarrays[J]. Environmental Microbiology，2008，10（11）：3057-3069.

[11] 鄭 燕，陳 哲，侯海軍，等. 典型水稻土微生物RNA的提取方法比較[J]. 環(huán)境科學(xué)，2010，31（4）：1066-1071.

[12] Freitag T E，Prosser J I. Correlation of methane production and functional gene transcriptional activity in a peat soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（21）：6679-6687.

[13] Nicol G W，Leininger S，Schleper C，et al. The influence of soil pH on the diversity，abundance and transcriptional activity of ammonia oxidizing archaea and bacteria[J]. Environmental Microbiology，2008，10（11）：2966-2978.

[14] Botero L M，D'Imperio S，Burr M，et al. Poly（A） polymerase modification and reverse transcriptase PCR amplification of environmental RNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（3）：1267-1275.

[15] Dandie C E，Miller M N，Burton D L，et al. Nitric oxide reductase-targeted real-time PCR quantification of denitrifier populations in soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（13）：4250-4258.

[16] Henry S，Bru D，Stres B，et al. Quantitative detection of the nosZ gene，encoding nitrous oxide reductase，and comparison of the abundances of 16S rRNA，narG，nirK，and nosZ genes in soils[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（8）：5181-5189.

[17] Hurt R A，Qiu X Y，Wu L Y，et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（10）：4495-4503.

[18] Wertz S，Dandie C E，Goyer C，et al. Diversity of nirk denitrifying genes and transcripts in an agricultural soil[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（23）：7365-7377.

[19] Henderson S L，Dandie C E，Patten C L，et al. Changes in denitrifier abundance，denitrification gene mrna levels，nitrous oxide emissions，and denitrification in anoxic soil microcosms amended with glucose and plant residues[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（7）：2155-2164.

[20] Griffiths R I，Whiteley A S，O'Donnell A G，et al. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（12）：5488-5491.

（責(zé)任編輯：成 平）