苑思坤，王庚南，崔明旭

（1．河北省保定市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 保定 071000； 2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000； 3．沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

高效液相色譜法測(cè)定老蔻丸中大黃酚含量

苑思坤1，王庚南2，崔明旭3

（1．河北省保定市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 保定 071000； 2．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，河北 保定 071000； 3．沈陽(yáng)藥科大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

目的 建立測(cè)定老蔻丸中大黃酚含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱為 Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇－0．1%磷酸（80∶20），流速為 1．0 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 254 nm，柱溫為25℃。結(jié)果 該方法專屬性強(qiáng)，大黃酚進(jìn)樣量在0．015 70～0．784 85 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為99．54%，RSD＝1．48（n＝6）。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性良好，可用于老蔻丸的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；老蔻丸；大黃酚

中成藥老蔻丸由大黃、當(dāng)歸、豆蔻、砂仁、肉桂、丁香、山楂、六神曲等24種中藥材組方，具有開郁舒氣、溫胃消食的功效，臨床主要用于肝郁氣滯、飲食不消、膨悶脹飽、胃脘疼痛等病癥[1]。方中大黃具有健胃[2－3]、增進(jìn)食欲、促進(jìn)消化的功效，對(duì)慢性胃炎有較好的療效[4]。祝金泉等[5]在關(guān)于大黃對(duì)胃黏膜細(xì)胞功能影響的研究中發(fā)現(xiàn)，大黃可促進(jìn)胃黏膜主細(xì)胞分泌胃蛋白酶，并可輕度增加胃黏膜細(xì)胞的增殖作用。文獻(xiàn)[6－11]報(bào)道，大黃對(duì)于老年胃潰瘍、應(yīng)激性胃潰瘍及胃潰瘍出血有良好的療效。大黃酚是大黃的主要成分之一，老蔻丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]中無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。為加強(qiáng)對(duì)該藥品的質(zhì)量控制，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法，對(duì)制劑所含有效活性成分大黃酚進(jìn)行含量測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，2998型DAD檢測(cè)器，Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），均由美國(guó)Waters公司生產(chǎn)；BT125D型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1．2 試藥

大黃酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110796－201118，含量為99．5%，供含量測(cè)定用）；老蔻丸（藥都制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)分別為140601，141101，150401）；甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher公司）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0．1%磷酸（80∶20）；流速：1．0 mL／min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按大黃酚峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取大黃酚對(duì)照品0．015 76 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含大黃酚15．70 μg的對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取供試品，剪碎，精密稱取5 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇10 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取除大黃的其余藥材，按制備工藝和處方比例制備陰性制劑，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取處方中除大黃以外的23味中藥材，按處方劑量及工藝要求制備缺大黃的陰性對(duì)照品，按2．2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。分別取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液和對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與大黃酚峰相同保留時(shí)間處，無(wú)相同色譜峰出現(xiàn)，表明除大黃外的其他原輔料對(duì)大黃酚峰均無(wú)干擾，見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2．2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液 1，2，5，10，20，50 μL注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝5 503．5 X－57 875，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，大黃酚進(jìn)樣量在0．015 70～0．784 85 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：精密吸取2．2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定大黃酚峰面積積分值。結(jié)果的 RSD＝0．46%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，在擬訂色譜條件下分別于2，4，6，8，10，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定大黃酚峰的面積。結(jié)果的 RSD＝1．03%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批供試品（批號(hào)為140601）6份，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算峰面積。結(jié)果大黃酚的平均含量為0．097 12 mg／g，RSD＝1．26%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取6份已知含量的供試品（批號(hào)為140601，大黃酚含量為為0．096 82 mg／g）各5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別精密量取貯備液0．5，1．0，2．0 mL各3份，加入6份樣品中，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測(cè)定

按擬訂方法制備3批（批號(hào)分別為140601，141101，150401）樣品的供試品溶液，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果3批樣品中大黃酚的含量分別為0．096 82，0．106 44，0．113 80 mg／g。

表1 大黃酚加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3 討論

老蔻丸屬中藥復(fù)方制劑，具有健胃消食、開郁舒氣、溫胃養(yǎng)胃的作用，方中大黃為寥科植物掌葉大黃Rheum palmatum L．、唐古特大黃 Rheum tanguticum Maxim．ex Balf．或藥用大黃 Rheum officinale Baill．的干燥根和根莖[12]，有瀉熱通暢、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、攻積導(dǎo)滯、利膽退黃之功效[13]，《神農(nóng)本草經(jīng)》稱大黃“主下瘀血、血閉、寒熱、破 瘕積聚、留飲、宿食、蕩滌腸胃、通利水谷、調(diào)中化食、安和五藏”。而大黃酚為大黃中主要活性成分，故本試驗(yàn)中以大黃酚為指標(biāo)，采用高效、便捷、準(zhǔn)確的HPLC法測(cè)定其含量。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：本試驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器，于200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示大黃酚在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

流動(dòng)相選擇：參考文獻(xiàn)[14－17]，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)與篩選，本試驗(yàn)中最終采用了甲醇－0．1%磷酸（80∶20）作為流動(dòng)相。結(jié)果大黃酚峰形良好，塔板數(shù)高，與周圍雜質(zhì)分離較完全，且方法的專屬性、精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性均較好。

提取方式選擇：參考文獻(xiàn)[16－17]，制劑中大黃酚的提取可采用甲醇、鹽酸2次回流，再用三氯甲烷多次振搖提取的方法。經(jīng)試驗(yàn)，的確可去除大量雜質(zhì)，但操作過于煩瑣，步驟過多，在操作過程中易產(chǎn)生誤差。本研究中供試品溶液的制備采用了超聲處理的方法，分別超聲10，20，30，40 min，測(cè)得大黃酚的含量最高為超聲30 min和40 min，認(rèn)為大黃酚在超聲30 min基本提取完全，故選用甲醇超聲處理30 min為宜。由試驗(yàn)結(jié)果可見，超聲提取的方法能確保大黃酚測(cè)定方法的良好專屬性及回收率，且操作簡(jiǎn)便，提高了試驗(yàn)效率及試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

耐用性考察：選取了3種不同品牌的色譜柱，即Waters Sunfire C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），資生堂Capcell Pak C18柱（200 mm×4．6 mm，5 μm），Phenomenex ODS3 C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm），測(cè)定同一批樣品，結(jié)果3種色譜柱測(cè)定結(jié)果重復(fù)性均較好。

柱溫試驗(yàn)：分別選擇柱溫為25℃和40℃時(shí)進(jìn)樣測(cè)定大黃酚的含量，結(jié)果兩者基本無(wú)差異，說(shuō)明在不同柱溫測(cè)定的結(jié)果重復(fù)性較好。最終選擇接近室溫的25℃為柱溫箱設(shè)定溫度。

綜上所述，本試驗(yàn)中建立的HPLC法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，線性方程、精密度、重復(fù)性、回收率均滿足要求，可作為中藥老蔻丸的質(zhì)量控制方法。

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Content Determination of Chrysophanol in Laokou Pills by HPLC

Yuan Sikun1，Wang Gengnan2，Cui Mingxu3
（1．Baoding Institute for Food and Drug Control，Baoding，Hebei，China 071000； 2．Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei，China 071000；3．ShenyangPharmaceutical University，Shenyang，Liaoning，China 110000）

Objective To establish an HPLC method for determination of the content of chrysophanol in Laokou Pills．M ethods Waters Sunfire C18column（250 mm×4．6 mm，5 μm）was used，the mobile phase was Methanol－0．1% phosphoric solution（80∶20），the flow rate was 1．0 mL／min，the detection wavelength was 254 nm，the column temperature was 25℃．Results This method had good specificity．The good linear relationship was found in the range of 0．015 70－0．784 85 μg，and the average recovery rate was 99．54%，RSD＝1．48(n＝6)．Conclusion This method has the advantages of simple operation，accurate results，and good reproducibility，can be used for the quality control of Laokou Pills．

HPLC；Laokou Pills；chrysophanol

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)10－0063－03

苑思坤（1983－），男，碩士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)、藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)及分析，（電話）0312－5906326（電子信箱）yuansikun＠sina．com；王庚南（1984－），女，講師，研究方向?yàn)樗幬锓治?、藥物代謝動(dòng)力學(xué)，本文通訊作者，（電話）0312－2020700（電子信箱）yiyuone＠sina．com。

2015－08－13；

2015－12－06)