霍勝楠，董海龍，鄭世超，孟 靜，楊振東

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101； 2. 山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250100)

基于PCR-RFLP技術(shù)鑒定常見食源性致病菌

霍勝楠1，董海龍2，鄭世超1，孟 靜1，楊振東2

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250101； 2. 山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250100)

根據(jù)細(xì)菌核糖體基因16S rRNA保守端 400 bp大小區(qū)段特征設(shè)計引物，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法建立一種新型靈敏的食源性致病菌鑒定技術(shù)。首先用特異性引物對9屬19種細(xì)菌基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用7種限制性內(nèi)切酶Eco52 Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ進(jìn)行消化酶切，再利用瓊脂糖凝膠電泳分辨酶切DNA片段大小數(shù)目，分析不同種屬細(xì)菌酶切產(chǎn)物態(tài)型，從而進(jìn)行基因型鑒別,針對16S rRNA基因片段利用RFLP進(jìn)行分析，結(jié)果表明：19種致病菌表現(xiàn)出10種特異性的RFLP圖譜，可準(zhǔn)確鑒定區(qū)分9屬細(xì)菌，最低檢測限可以達(dá)到1 pg/μL。這證明PCR-RFLP技術(shù)可用于常見食源性致病菌的快速鑒定。

食源性致病菌;分子標(biāo)記物;PCR-RFLP;細(xì)菌分類鑒定

近年來，國內(nèi)外食源性疾病事件頻頻發(fā)生，對食源性疾病的預(yù)防與控制已引起了世界各國關(guān)注。傳統(tǒng)檢測方法把細(xì)菌是否可培養(yǎng)作為判斷的標(biāo)準(zhǔn)，試劑操作中可能會發(fā)生漏檢、易污染等狀況[1-2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子和基因水平鑒定微生物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，如酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)、熒光定量PCR技術(shù)、脈沖場電泳(PFGE)、核糖體分型(ribotyping)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(RAPD)、基因測序等[3-5]。但是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)特異性不強(qiáng)容易出現(xiàn)假陽性，熒光定量PCR技術(shù)、脈沖場電泳和核糖體提分型耗時、費(fèi)力，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析鑒別力低，基因芯片檢測成本高、特異性有待提高。建立在PCR基礎(chǔ)上的限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)首先通過擴(kuò)增病原菌的特異性基因片段，然后再通過酶切產(chǎn)物電泳圖譜分析進(jìn)行細(xì)菌屬的鑒定甚至屬內(nèi)種的鑒定[6]。PCR-RFLP技術(shù)是PCR技術(shù)、RFLP技術(shù)與凝膠電泳方法的聯(lián)合應(yīng)用，該技術(shù)操作簡單、快速，對實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)技術(shù)要求低，為細(xì)菌鑒定提供了強(qiáng)有力的工具[7]。

細(xì)菌的保守基因常常被選作鑒別診斷的靶基因[8]，段瑩等[9]和宋艷等[10]分別對食源性致病菌PCR方法檢測中常用的靶基因及其引物進(jìn)行了整理，并得出有用的編碼基因。由于16S rRNA基因序列的保守性和存在的普遍性，該基因序列本身的穩(wěn)定性以及RFLP技術(shù)能夠識別等位基因間堿基的替換、重組和缺失等變化，應(yīng)用16S rRNA作為分子指標(biāo)，16S rRNA PCR-RFLP分析技術(shù)可以預(yù)測16S rRNA基因全序列分析結(jié)果，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在屬的水平上的準(zhǔn)確鑒定。研究表明，利用擴(kuò)增16S rRNA方法可將分離自乳酪的54種乳酸菌按照屬別準(zhǔn)確分類[11]。應(yīng)用RFLP技術(shù)也可將產(chǎn)黃曲霉毒素的真菌跟普通真菌特異性區(qū)分開來[12]。隨著更多細(xì)菌基因組序列被解密，16S rRNA序列分析的準(zhǔn)確性會不斷提高。但是由于16S rRNA基因本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在親緣關(guān)系密切的種屬之間序列高度相似，甚至完全一致，利用一種限制性內(nèi)切酶結(jié)果往往不能較好地對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行種屬鑒定，使得利用16S rRNA序列分析在它們之間的應(yīng)用受到一定限制。16S rDNA PCR-RFLP分析技術(shù)可以預(yù)測16S rRNA基因全序列分析結(jié)果，此技術(shù)操作簡易，時間短，可避免傳統(tǒng)RFLP方法中DNA酶切片段轉(zhuǎn)移、雜交等復(fù)雜步驟，不需要特殊的雜交設(shè)備，即可快速獲得分析結(jié)果。

本研究采用細(xì)菌核糖體基因16S rRNA基因保守片段設(shè)計通用引物，用7種限制性內(nèi)切酶消化酶解消化特異性擴(kuò)增片段，以此得到特異的酶解片段態(tài)型，已建立快速方便鑒定9屬19種常見食源性致病菌的方法，為快速檢測食源性致病菌和進(jìn)行菌株分型提供可靠的分子生物學(xué)平臺。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCR擴(kuò)增反應(yīng)Premix Taq? Version 2.0(Loading dye Mix)、DNA Marker(DL2 000TM、DL500TM)、限制性內(nèi)切酶(Eco52 Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ)、RNase A、蛋白酶K、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，寶生物工程(大連)有限公司；梯度PCR儀ProFlex，美國AB公司；電泳系統(tǒng)Sub-Cell GT，美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)EC3，美國UVP公司。

1.2 菌株的選擇與培養(yǎng)

標(biāo)準(zhǔn)菌株：選取福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri，CICC21534)、宋氏志賀氏菌(Shigellasonnei，CICC21535)、單胞細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，CICC21579、CICC21633、CICC21632)、英諾克李斯特氏菌(Listeriainnocua，CICC10417)、伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii，CICC21663)、出血性大腸埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC O 157: H und，CICC21531)、致瀉大腸埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC O 127: K63，CICC10411)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，CICC21585)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae，CICC21539)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazaki,CICC21560)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus，CICC10349、CICC10277)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，CICC21485)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CICC10373)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，CICC10294)、副溶血性弧菌(VirioParahemolyticus，CICC21617)和乙型溶血性鏈球菌(Streptococcushemolytic-β，CICC10373)共計19種，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)。將上述菌株按照常規(guī)方法進(jìn)行復(fù)蘇后接種于相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24～36 h。

1.3 菌株活化及生化鑒定

實(shí)驗(yàn)菌株在營養(yǎng)瓊脂(NA)上進(jìn)行分離培養(yǎng)，根據(jù)所購菌株的說明書對活化菌株進(jìn)行鏡檢及相應(yīng)生理生化鑒定。挑取鑒定陽性的單菌落接種至10 mL LB肉湯，36 ℃，培養(yǎng)過夜備用。

1.4 DNA模板的制備

取0.5～4.0 mL培養(yǎng)液離心收集細(xì)菌，采用寶生物公司貨號9765的Universal Genomic DNA Extraction Kit方法進(jìn)行DNA提取。

1.5 16S rRNA基因擴(kuò)增因?yàn)榈脑O(shè)計與合成

首先在GneBank中獲取所需的16S rRNA基因序列，利用DNAman軟件進(jìn)行16S rRNA基因的全序列比對，設(shè)計可以廣譜擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物D790(5′-agataccctggtagtccacgc-3′)和D1196(5′-tgacgtcatccccaccttc-3′)，擴(kuò)增片段大小約為400 bp(引物位置以福氏志賀氏菌核糖體DNA 16S rRNA基因序列為準(zhǔn))。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.6 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化

以實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA為模板，通過通用引物的擴(kuò)增，進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用50 μL反應(yīng)體系：Premix Taq Version預(yù)混液25 μL，模板DNA(50 ng/μL)2 μL，引物D790(10 μmol/L)2 μL，引物D1196(10 μmol/L)，加重蒸水補(bǔ)足至50 μL。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過35個循環(huán)，最后72 ℃后延伸10 min。

1.7 PCR檢測靈敏度分析

以無菌操作將金黃色葡萄球菌基因組DNA做模板，按10倍遞增逐級稀釋，自100 ng/μL質(zhì)量濃度稀釋至0.1 pg/μL，分別做靈敏度測試。

1.8 16S rDNA基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切

運(yùn)用DNAclub軟件對16S rRNA基因目標(biāo)擴(kuò)增片段區(qū)域序列進(jìn)行限制性內(nèi)切位點(diǎn)分析，通過比較，最終選取Eco52 Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ進(jìn)行擴(kuò)增片段的酶切分析。

1.9 RFLP分析

取5 μL酶切產(chǎn)物在2%瓊脂凝膠中，電壓80 V下電泳30 min。電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察并拍照分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同細(xì)菌基因組DNA提取及純度檢測

采用改良的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver 3.0方法提取細(xì)菌基因組DNA，所得DNA質(zhì)量濃度均大于50 ng/μL，A260/A280值在1.8～2.0之間。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示所有DNA條帶均清晰明亮，無拖尾擴(kuò)散。這說明使用所得DNA濃度大、純度高、無降解現(xiàn)象，可用于下一步PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1顯示19種菌株的16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。由圖1可知：所有菌株的擴(kuò)增片段大小約為400 bp，條帶清晰明確，擴(kuò)增效果好，無干擾性雜帶出現(xiàn)。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步測序分析，結(jié)果顯示所得擴(kuò)增片段與NCBI網(wǎng)站登記16S rRNA基因序列片段一致，可以進(jìn)行后續(xù)限制性內(nèi)切酶分析。

圖1 設(shè)計引物PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplification products by the designed specific primers

2.3 PCR檢測靈敏度分析結(jié)果

圖2為不同濃度PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。由圖2可知：經(jīng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，0.1 pg/μL模板依然可得到明亮清晰的條帶，說明本研究建立的PCR檢測方法在DNA模板濃度105～0.1 pg/μL的范圍內(nèi)，均可得到陽性結(jié)果，檢測靈敏度判斷為0.1 pg/μL。

圖2 靈敏度測試結(jié)果 (以金黃色葡萄球菌為檢測細(xì)菌)Fig.2 Electrophoresis results of the PCR detection limit(the Staphylococcus aureus as detected target)

2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切結(jié)果及分析

19種食源性致病菌16S rRNA基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)選定酶酶切后，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后分析比較，酶切產(chǎn)物的電泳見圖3。由圖3可知：Eco52 Ⅰ可以切開沙門氏菌、志賀氏菌、埃希氏菌和腸桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物，而無法切開李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和副溶血性弧菌。

利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化細(xì)菌16S rRNA目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)HindⅢ僅能切開金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的擴(kuò)增產(chǎn)物，其他菌株P(guān)CR產(chǎn)物無法被酶切斷。根據(jù)序列分析，在革蘭氏陽性芽孢桿菌屬細(xì)菌16S rRNA目標(biāo)序列中出現(xiàn)MboⅠ酶切位點(diǎn)。

利用該酶對PCR產(chǎn)物酶切，結(jié)果顯示MboⅠ酶可切開蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，無法切開其他菌株P(guān)CR產(chǎn)物。

在革蘭氏陰性菌志賀菌屬、大腸埃希菌屬、腸桿菌屬、沙門氏菌屬以及弧菌屬中16S rRNA目標(biāo)序列中均存在MluⅠ酶酶切位點(diǎn)。利用限制性內(nèi)切酶MluⅠ酶消化待測25中細(xì)菌PCR產(chǎn)物，電泳結(jié)果顯示共有13種細(xì)菌可被切斷擴(kuò)增產(chǎn)物，而其他12種菌株擴(kuò)增產(chǎn)物無法被切開。

根據(jù)序列革蘭氏陽性葡萄球菌屬、李斯特氏菌屬、枯草芽孢桿菌屬及阪崎腸桿菌屬細(xì)菌在本實(shí)驗(yàn)所選取的16S rRNA目標(biāo)序列，其中存在PstⅠ酶酶切位點(diǎn)。根據(jù)電泳結(jié)果，9種革蘭氏陽性菌PCR產(chǎn)物可被切斷，其中金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、英諾克李斯特菌和伊氏李斯特菌可被切為338和68 bp 2種片段(圖3)，而阪崎腸桿菌PCR產(chǎn)物則被酶切斷為188和219 bp 2種大小相當(dāng)?shù)钠?。同為腸桿菌屬的陰溝腸桿菌并未出現(xiàn)酶切產(chǎn)物片段。

圖3亦顯示其他菌株P(guān)CR產(chǎn)物未出現(xiàn)酶切產(chǎn)物片段。根據(jù)序列分析，在革蘭氏陰性志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌屬及腸桿菌屬細(xì)菌16S rRNA目標(biāo)序列中存在SalⅠ酶切位點(diǎn)。由圖3可知：志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌屬細(xì)菌以及阪崎腸桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物都可被SalⅠ酶酶切為3個片段，而其他菌屬細(xì)菌無酶切片段出現(xiàn)。在革蘭氏陽性鏈球菌屬、葡萄球菌屬細(xì)菌16S rRNA目標(biāo)序列中出現(xiàn)XbaⅠ酶切位點(diǎn)。對各種待檢細(xì)菌酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，如圖3所示，乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌目標(biāo)片段可被XbaⅠ酶切斷為大小、亮度相當(dāng)?shù)?個片段，其他菌株片段均不可被酶切。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將9屬細(xì)菌共可得到10種不同的酶切態(tài)型進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果見表1。由表1可知，10種態(tài)型可準(zhǔn)確界定19種細(xì)菌的屬間區(qū)別。福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、出血性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌以及大腸埃希氏菌都可被Eco52 Ⅰ酶、MluⅠ酶和SalⅠ酶內(nèi)切為單重態(tài)型，單核李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可被僅可被PstⅠ酶消化產(chǎn)生一種態(tài)型。同為腸桿菌屬的陰溝腸桿菌和阪崎腸桿菌所得態(tài)型不同，陰溝腸桿菌可被Eco52 Ⅰ酶和MluⅠ酶酶切得到2種態(tài)型，而阪崎腸桿菌除相同2種態(tài)型外，還可被PstⅠ酶和SalⅠ酶內(nèi)切得到另外2種態(tài)型。蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌也可得到不同的酶切態(tài)型，蠟樣芽孢桿菌可被Eco52 Ⅰ酶內(nèi)切開，而枯草芽孢桿菌則可被PstⅠ酶內(nèi)切為兩種長度的片段。3種沙門氏菌都可被Eco52 Ⅰ酶和MluⅠ酶內(nèi)切從而得到同屬態(tài)型。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌則也可得到相同的葡萄球菌屬態(tài)型。副溶血性弧菌僅可被PstⅠ酶內(nèi)切得到一種態(tài)型，而所選的7種內(nèi)切酶均不可切斷溶血性鏈球菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，始終保持400 bp片段長度，也可將溶血性鏈球菌與其他細(xì)菌特異性區(qū)分。各菌種酶切所得的DNA片段數(shù)目與大小也各有不同，呈現(xiàn)出限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性現(xiàn)象。經(jīng)過分析計算，各菌的片段數(shù)目以及大小均與理論數(shù)相符。

圖3 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切產(chǎn)物RFLP分析Fig.3 RFLP results of digested products of food-borne pathogens

總的來說，MluⅠ酶切片段可作為革蘭氏陰性、革蘭氏陽性細(xì)菌間鑒定的特征RFLP圖譜。對于革蘭氏陽性菌，MboⅠ酶切片段圖譜可作為革蘭氏陽性芽孢桿菌屬細(xì)菌鑒定的特征圖譜，而革蘭氏陽性鏈球菌屬、葡萄球菌屬細(xì)菌則可通過XbaⅠ酶切片段圖譜與其他細(xì)菌加以區(qū)分。限制性內(nèi)切酶HindⅢ對于革蘭氏陽性葡萄球菌屬細(xì)菌基因片段的酶切片段圖譜可以作為他們鑒定的特征RFLP圖譜。對于革蘭氏陰性細(xì)菌，PstⅠ酶酶切阪崎腸桿菌產(chǎn)生大小相當(dāng)?shù)膬蓚€片段，與其他細(xì)菌均不相同，而且SalⅠ酶僅可對阪崎腸桿菌進(jìn)行消化酶切，不會對陰溝腸桿菌基因片段產(chǎn)生消化作用，因此，這2種內(nèi)切酶的酶切基因片段圖譜可以作為區(qū)分阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌的特征圖譜。限制性內(nèi)切酶Eco52 Ⅰ既可對革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生消化酶切，又可對革蘭氏陰性細(xì)菌消化酶切。這對革蘭氏陰性沙門氏菌屬與革蘭氏陽性芽孢桿菌屬細(xì)菌16S rRNA PCR-RFLP圖譜一致，無法對上述兩屬間細(xì)菌特異性予以區(qū)別；革蘭氏陰性志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌屬、腸桿菌屬細(xì)菌16S rRNA PCR-RFLP圖譜一致，亦無法對上述細(xì)菌屬間特異性予以區(qū)別；但可以通過有無酶切片段，判斷待檢細(xì)菌屬蠟樣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌，或待檢細(xì)菌是否沙門氏菌。

表1 限制性內(nèi)切酶對常見19種食源性致病細(xì)菌16S rRNA目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)物消化結(jié)果Table 1 Results of digested products in 19 species pathogens of 9 families bp

本實(shí)驗(yàn)中Eco52 Ⅰ可將出血性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、大腸埃希氏菌、陰溝腸桿菌和阪崎腸桿菌的目標(biāo)基因酶切為相同的3個基因片段，使得兩屬細(xì)菌無法區(qū)分，但是結(jié)合PstⅠ和SalⅠ酶切結(jié)果，埃希氏菌可被SalⅠ酶切但不可被PstⅠ酶切，阪崎腸桿菌可同時被PstⅠ和SalⅠ酶切，陰溝腸桿菌目標(biāo)基因則既不能被PstⅠ酶切也不能被SalⅠ酶切(表1)，從而結(jié)合3種限制性內(nèi)切酶酶切結(jié)果可輕易將兩屬細(xì)菌區(qū)分，并且可對阪崎腸桿菌和陰溝腸桿菌進(jìn)行屬內(nèi)種間區(qū)分。說明綜合多種限制性內(nèi)切酶消化結(jié)果分析，可提高RFLP分析方法的準(zhǔn)確性和效率。

3 結(jié)論

本研究選取16S rRNA的保守區(qū)域設(shè)計通用引物，擴(kuò)增特異性400 bp大小基因片段，然后應(yīng)用7種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化酶解，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果建立RFLP特征圖譜，可準(zhǔn)確區(qū)別鑒定9屬常見的食源性致病菌，并可對陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌進(jìn)行屬內(nèi)種間鑒定。該方法不但操作方便，可實(shí)現(xiàn)大量樣本多種目標(biāo)菌屬同時檢測，而且通過區(qū)別RFLP圖譜，可特異性準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌歸屬，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率和準(zhǔn)確性，從而利于食源性致病菌的快速鑒別。

[1] 邱楊,田聰,余以剛,等.食源性致病菌活菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國動物檢疫,2011,28(10):63-65.

[2] 李紅兵,秦巖,余秀蓮.乙酰螺旋霉素微生物檢定條件的改進(jìn)[J].藥學(xué)研究,1997(4):6.

[3] JIN D Z,WEN S Y,CHEN S H,et al.Detection and identification of intestinal pathogens in clinical specimens using DNA microarrays[J].Mol Cell Probes,2006,20(6):337-347.

[4] CHIANG Y C,YANG C Y,LI C,et al.Identification ofBacillusspp.,Escherichiacoli,Salmonellaspp.,Staphylococcusspp.andVibriospp.with 16S ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization[J].Int J Food Microbiol,2006,107(2):131-137.

[5] KIM H J,PARK S H,LEE T H,et al.Microarray detection of food-borne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics[J].Biosens Bioelectron,2008,24(2): 238-246.

[6] 楊霞,陳陸,王川慶.16S rRNA基因序列分析技術(shù)在細(xì)菌分類中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,36(2):55-60.

[7] MARTY E,BUCHS J,EUGSTER-MEIER E,et al.Identification ofStaphylococciand dominant lactic acid bacteria in spontaneously fermented Swiss meat products using PCR-RFLP [J].Food Microbiol,2012,29(2):157-166.

[8] 王艇,蘇應(yīng)娟,朱建明,等.紅豆杉科及相關(guān)類群rbcL基因PCR-RFLP分析[J].植物學(xué)通報，2001,18(6):714-721.

[9] 段瑩,陶景玉,盧行安,等.PCR方法檢測食品中致病菌常用的靶基因及其引物[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2006,18(4): 339-341.

[10] 宋艷,李建林,鄭鐵松.食源性致病菌PCR檢測中常用的靶基因及其參考引物[J].食品工業(yè)科技,2011,32(1):371-375.

[11] 段宇珩,談重芳,王雁萍,等.乳酸菌鑒定方法在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技,2007(2):242-244.

[12] El KHOURY A,ATOUI A,RIZK T ,et al.Differentiation betweenAspergillusflavusandAspergillusparasiticusfrom pure culture and aflatoxin-contaminated grapes using PCR-RFLP analysis ofaflR-aflJintergenic spacer[J].J Food Sci,2011,76(4):M247-M253.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Identification of common food-borne pathogens based on PCR-RFLP techniques

HUO Shengnan1,Dong Hailong2,ZHENG Shichao1,MENG Jing1,YANG Zhendong2

(1.Shandong Institute for Food and Drug Control,Jinan 250101,China;2.Shandong Institute for Product Quality Inspection,Jinan 250100,China)

This study adopted a polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method to analyze food-borne pathogens mitochondrial.16S rRNA from 19 kinds food-borne pathogens were amplified.With ribosomal gene 16S rRNA as the special attractant,a trail to digest the target gene by restrictive enzymesEco52 Ⅰ,HindⅢ,MboⅠ,MluⅠ,PstⅠ,SalⅠ andXbaⅠ was carried out after PCR amplification of a specific 400 bp region of this gene,and the restriction fragments were analyzed by agarose gel electrophoresis.The digested products of the 16S rRNA of different food-borne pathogens manifested in specific patterns.The lowest detection limit is 1 pg/μL.These results showed that the genotype verification of 16S rRNAs by PCR-RFLP method proved to be a good tool for detecting foodborne pathogens.

food-borne pathogens;molecule marker;polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP);classification

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.005

2016-07-05

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金(BS2010SW024)

霍勝楠(1980—)，女，山東淄博人，博士，高級工程師，研究方向：分子生物學(xué)技術(shù)，E-mail:huosn@163.com

S661.2

A

1672-3678(2016)06-0023-06