韓夢琪，孫 卓，金永國，馬美湖

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070)

蛋黃液中沙門氏菌溫度預(yù)測模型的建立

韓夢琪，孫 卓，金永國，馬美湖

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070)

為探究溫度對沙門氏菌在蛋液中生長規(guī)律的影響，測定了在4、10、15、20、25、30、37和42 ℃等不同溫度下沙門氏菌的生長曲線，利用Origin 8.0軟件中非線性最小二乘法的原理進行修正Gompertz方程、修正Logistic方程的擬合以及DMFit軟件進行Baranyi模型的擬合，研究結(jié)果表明修正Gompertz模型、修正Logistic模型和Baranyi模型均能得到較高的決定系數(shù)(>0.99)，選取決定系數(shù)相對較高的修正Logistic模型進行一級模型的建立。通過參數(shù)估計后利用Ratkowsky模型對最大比生長速率以及遲滯期進行二級模型的擬合，通過Baranyi模型得到的生長參數(shù)建立的二級模型擬合度高于其他模型，最大比生長速率以及遲滯期二級模型決定系數(shù)分別為0.978和0.866。經(jīng)檢驗，研究建立的模型可用于10～42 ℃溫度范圍內(nèi)蛋黃液中沙門氏菌的生長預(yù)測。

蛋黃液；沙門氏菌；預(yù)測模型

在我國細菌性食物中毒中，70%～80%的案例是由沙門氏菌引起，我國風險監(jiān)測顯示：蛋及蛋制品中沙門氏菌的檢出率為3.9%～43.7%[1]。沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，形態(tài)呈兩端鈍圓的短桿菌，目前研究中分離得到的沙門氏菌有2 500余種血清型，其中與人類疾病有關(guān)的常見血清型為鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌以及腸炎沙門氏菌[2]。

利用預(yù)測微生物學(xué)的原理，根據(jù)主要的環(huán)境因子例如溫度、水分活度、pH等對微生物致病菌以及腐敗菌在生長中的影響建立一系列模型，應(yīng)用這些預(yù)測模型可以快速有效地對微生物的生長、存活和死亡進行預(yù)測[3]，為微生物定量風險評估(QMRA)和危害分析關(guān)鍵控制點(HACCP)以及食品貨架期預(yù)測提供科學(xué)的依據(jù)，從而確保食品在生產(chǎn)、加工和流通等過程中的安全。隨著預(yù)測微生物學(xué)在20世紀90年代的迅猛發(fā)展以及沙門氏菌污染在食源性疾病案例的頻繁出現(xiàn)，針對沙門氏菌的預(yù)測模型研究涉及的食物種類繁多，其中包括肉類與肉制品、蛋與蛋制品、蔬菜和熟食等。

蛋類及其制品感染或污染沙門氏菌的風險較大，帶菌率可高達30%～40%[4]。蛋液的生產(chǎn)中易受到沙門氏菌感染，蛋清中沙門氏菌的生長被其中的溶菌酶等抗菌物質(zhì)抑制到最低程度[5]，而蛋黃中鮮有報道對沙門氏菌有抑制作用的物質(zhì)，所以沙門氏菌在蛋黃內(nèi)易生長并大量繁殖，研究不同溫度下蛋黃液中沙門氏菌的生長規(guī)律并建立預(yù)測模型具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

沙門氏菌(SJTUF10984、SJTUF10978和ATCC13076)；菌株分離自受污染的蛋液產(chǎn)品中，SJTUF10984與SJTUF10978為腸炎沙門氏菌，ATCC13076為沙門氏菌標準菌株。以上菌株均貯存于-80 ℃、20%甘油中。菌株接種于胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，活化三代備用。

新鮮雞蛋，海蘭褐品種(產(chǎn)蛋時間<48 h)，購買自湖北省武漢市九峰山養(yǎng)雞場。

木糖賴氨酸去氧膽酸(XLD)培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責任公司；TSB培養(yǎng)基，青島海博公司。培養(yǎng)基的配制方法參照廠家說明書。

1.2 儀器

YM75型立式電熱蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；ZHWY-2102C型立式雙層恒溫搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速臺式離心機，德國SIGMA公司；SPX-250BS-1型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AR2140型分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；1 mL、200 μL移液槍，德國Eppendorf公司；FE20型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；RW20型電動攪拌機，德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

將沙門氏菌劃線至XLD平板，挑取黑心有光澤的典型菌落接種至無菌TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)16～24 h，將3個菌種的菌液通過渦旋振蕩器充分混合，通過磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋104倍，得到最終混合菌種的菌懸液。

1.3.2 蛋黃液的制備

將雞蛋在流水下洗凈，待干后再用75%乙醇棉消毒蛋殼，并在紫外燈下照射15 min，以無菌操作打開蛋殼取出蛋液，用消過毒的分蛋器使蛋黃與蛋清分離，將蛋黃放入帶有玻璃珠的滅菌瓶內(nèi)，充分搖勻并攪拌待用。

1.3.3 樣品接種

將準備好的蛋黃液以10 g每份的量分裝至50 mL無菌離心管中，置于恒溫(4、10、15、20、25、30、37和42 ℃)生化培養(yǎng)箱中，使其與培養(yǎng)箱溫度達到平衡，1 h后取出準備接種。向每個加入10 g蛋黃液的離心管中加入200 μL接種菌液，使得初始接種濃度在1.5×104～1.5×105CFU/g。將接種后的樣品管與對照管置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 沙門氏菌計數(shù)

采取XLD瓊脂培養(yǎng)基對沙門氏菌進行平板計數(shù)。在本研究的8個實驗組中，在30、37和42 ℃條件下每隔2 h計數(shù)一次，在20、25 ℃時每隔5 h計數(shù)一次，在10、15 ℃條件下每隔12 h計數(shù)一次，在4 ℃條件下每隔24 h計數(shù)一次。每個實驗組重復(fù)2次。

1.3.5 生長模型的建立

分別采用修正Gompertz方程、修正Logistic方程以及Baranyi方程進行沙門氏菌生長曲線的擬合，估算生長曲線的最大比生長速率(growth rate,μmax)以及遲滯期(lag time，λ)。修正Gompertz方程、修正Logistic方程應(yīng)用美國OringinLab公司開發(fā)的OringinPro for Windows(V7.5)軟件中的Levenberg-Marquardt法(非線性最小二乘法)進行擬合，修正Gompertz方程為

(1)

式中：A是初始菌對數(shù)濃度N0，C是初始菌濃度和最大菌濃度的差值，M是生長速率達到最大的時間，B是M時相對最大生長速率。轉(zhuǎn)化成生物學(xué)意義方程為[6]

(2)

修正Logistic方程為

(3)

轉(zhuǎn)化成生物學(xué)意義方程為[6]

(4)

Baranyi方程應(yīng)用英國食品研究中心(Institute of Food Reasearch,IFR)開發(fā)的DMFit v2.0 軟件，軟件依據(jù)的方程為

(5)

(6)

(7)

式中：Y0和Ym分別是最初菌對數(shù)濃度和最終菌對數(shù)濃度，μmax是最大比生長速率(h-1)，λ是遲滯期(h)。

一級模型的校驗利用決定系數(shù)R2進行評價。二級模型采取由Belehradek創(chuàng)立，Ratkowsky等改進的平方根模型：

(8)

(9)

式中：T是攝氏溫度(℃)，Tmin假設(shè)了微生物沒有代謝活動時的溫度，b值為常數(shù)。

1.3.6 模型評價

一級模型的決定系數(shù)采用決定系數(shù)R2評價生長參數(shù)的評估采用SPSS軟件進行分析，二級模型采用殘差平方和(RSS)，平方根誤差(RMSE)、偏差因子(Bf)和準確性因子(Af)來評定，表達式如下：

RSS=∑(obs-pred)2

(10)

(11)

(12)

(13)

式中：obs為用一級模型擬合中的3種方程擬合的蛋液中沙門氏菌生長曲線的生長參數(shù)μmax或λ的觀測值，pred為用建立的沙門氏菌在蛋液中的生長模型的預(yù)測值。

2 結(jié)果與討論

2.1 一級模型的擬合

在實驗選取的溫度范圍中對模型進行擬合，結(jié)果見表1和圖1。由表1可知：在4 ℃條件下的生長曲線無法使用3種模型對其進行擬合，沙門氏菌數(shù)未觀測到顯著的生長現(xiàn)象，且在培養(yǎng)96 h后，沙門氏菌數(shù)呈現(xiàn)失活趨勢，由線性回歸分析可得失活曲線斜率在0.001 8左右。由圖1可知：在10、15、20、25、30、37和42 ℃條件下，沙門氏菌在蛋黃液中的生長曲線均能和研究中選取的3種模型較好地擬合(R2>0.971)，呈現(xiàn)較為顯著的“三段式”S型生長曲線。由表1可知：修正Gompertz方程、修正Logistic方程和Baranyi模型平均決定系數(shù)分別為0.992、0.995和0.993，決定系數(shù)值比較接近，修正Logistic方程進行一級擬合的R2值最高。對Nt繪制相對時間(t)的曲線圖，圖1中的曲線由修正Logistic模型擬合而得。相同溫度下決定系數(shù)在各個模型擬合結(jié)果之間的差異，而溫度不同決定系數(shù)在模型內(nèi)也呈現(xiàn)差異，例如在37、10℃條件下各個模型的決定系數(shù)均較低。

2.2 生長參數(shù)與二級模型

Baranyi模型通過DMFit軟件擬合得到生長參數(shù)μmax、λ及統(tǒng)計分析后，結(jié)果如表2所示。由表2可知：在試驗溫度范圍內(nèi)，溫度的升高使μmax逐漸增大，而遲滯期結(jié)果在37 ℃條件以外的其他溫度條件下，隨著溫度升高呈縮短趨勢變化。修正Gompertz方程、修正Logistic方程和Baranyi模型擬合一級模型之后分別得到相應(yīng)的最大比生長速率值以及遲滯期值，將擬合得到的μmax進行比較分析，分別代入到Ratkowsky方程中進行線性回歸分析，決定系數(shù)均大于0.97，將擬合得到的λ值進行比較分析，Barayi模型與修正Gompertz方程決定系數(shù)能達到0.89以上。結(jié)合2次擬合的決定系數(shù)比較，選用Baranyi模型擬合的一級模型得到的最大比生長速率值以及遲滯期值進行沙門氏菌在蛋黃液中溫度二級模型建立，二級模型擬合結(jié)果如圖2所示，得到的Ratkowsky模型見式(14)～(15)。

表1 修正Gompertz方程、修正Logistic方程參數(shù)及統(tǒng)計分析Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz function and modified Logistic function

圖1 不同溫度條件下沙門氏菌在蛋黃液中一級模型的建立Fig.1 Primary growth model of Salmonella in egg yolk at different temperature

(14)

(15)

表2 應(yīng)用Baranyi模型擬合求得不同溫度下的 沙門氏菌生長曲線的生長參數(shù)Table 2 Parameters growth rate and lag time of Salmonellabacteria obtained from Baranyi model

圖2 不同溫度下沙門氏菌在蛋液中的二級生長模型Fig.2 Secondary models of Samonella atdifferent temperature

模型采用殘差平方和(RSS)、平方根誤差(RMSE)、偏差因子(Bf)和準確性因子(Af)的評定結(jié)果，見表3、4。

根據(jù)病原菌Bf值的劃分標準來說，0.9

表3 最大比生長速率(μmax)的預(yù)測值與實際值統(tǒng)計學(xué)分析Table 3 Statistics analysis of μmax between predicted value and observed value

表4 遲滯期(λ)的預(yù)測值與實際值統(tǒng)計學(xué)分析Table 4 Statistics analysis of λ between predicted value and observed value

實驗中研究了蛋黃液在生產(chǎn)加工和流通中波動最大的因素——溫度變化下生長的規(guī)律，選取冷藏溫度4 ℃以及10～42 ℃的溫度范圍內(nèi)的條件建立了相應(yīng)的一級模型和二級模型。在10、15、20、25、30、37和42 ℃條件下，用修正Gompertz方程、修正Logistic方程和Baranyi模型擬合得到的一級模型的決定系數(shù)R2>0.97，均能較為準確的預(yù)測相應(yīng)溫度條件下沙門氏菌在蛋黃液中的生長，但修正Logistic方程決定系數(shù)相對較高。Szczawinska等[7]在熟火腿中以及Sakha等[8]在殺菌液全蛋與未殺菌液全蛋中建立的沙門氏菌溫度模型有相同結(jié)果。與之相反，Juneja等[9]等在雞肉的研究中、國內(nèi)學(xué)者在草魚魚糜中[10]、殺菌液全蛋[11]以及冷卻牛肉中[12]建立的沙門氏菌溫度生長模型以及冷卻豬肉[13]中建立氣單胞菌溫度生長模型，都發(fā)現(xiàn)修正Gompertz方程的擬合度更高。修正Logisti方程與修正Gompertz方程均是較為常用的經(jīng)驗?zāi)Ｐ停鳥aranyi模型是真正意義上的動力學(xué)模型[14]。高麗娟等[15]在新鮮豬肉濾汁中用Baranyi模型與Ratkowsky模型建立了較為準確的一級和二級模型。而本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：僅從擬合度上來說，沙門氏菌的一級生長模型在應(yīng)用修正Gompertz模型、Logistic模型和Baranyi模型擬合時差別并不大，但采用Ratkowsky模型進行二級模型的擬合時，Baranyi模型估計的參數(shù)更適用于二級模型的建立，在Juneja等[16]在牛肉中建立的沙門氏菌溫度模型也證實Baranyi模型更適用于一級模型與二級模型結(jié)合的整體研究中。

實驗結(jié)果顯示：在4 ℃條件下，沙門氏菌在蛋黃液中無法生長，但失活速率較小(k<0.001 8)，且由本文建立的二級模型可推知，沙門氏菌在蛋黃液中的沒有代謝活動的溫度Tmin在-0.62～0.53，雖然這只是理論模型的推測，實際在4 ℃條件下已觀察不到生長現(xiàn)象，但是這證實研究中的生長速率二級模型在10 ℃以下的低溫環(huán)境中并不能適用。在10～42 ℃的范圍內(nèi)，所得到的生長速率二級模型還是可以預(yù)測沙門氏菌在蛋黃液中的實際生長速率值，雖然本研究所建立模型所得預(yù)測值相對實際值略有偏高，但是這有利于其在實際的風險評估與食品管理中應(yīng)用的安全性[15]。本文對遲滯期的預(yù)測準確性比對生長速率的預(yù)測準確性要低，遲滯期的預(yù)測不夠準確主要是實驗過程中無法保證沙門氏菌接種狀態(tài)完全相同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差所致。

3 結(jié)論

筆者所建立的沙門氏菌的溫度預(yù)測模型可以可靠地預(yù)測沙門氏菌在10～42 ℃的溫度范圍內(nèi)在蛋黃液中的生長情況，影響沙門氏菌生長的因素還有水分活度、鹽度和pH等因素，溫度是主要的影響因素之一。通過研究不同溫度條件下蛋黃液中沙門氏菌的生長模型，可以為蛋黃液中沙門氏菌污染的預(yù)測和監(jiān)控提供有效的工具，以提高產(chǎn)品的安全性，下一步可探究鹽度等其他蛋黃中變化較大的因素來進行模型建立，更加完善沙門氏菌在蛋黃液中的預(yù)測模型研究。

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(責任編輯 管珺)

Development of a predictive model for Salmonella in egg yolk atdiferrent temperatures

HAN Mengqi,SUN Zhuo,JIN Yongguo,MA Meihu

(College of Food Science & Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070,China)

To study the growth ofSalmonellain the egg yolk, we measured growth curves at different temperatures (10,15,20,25,30,37 and 42 ℃).The modified Gompertz function and The modified Logistic function were applied to fit the growth curves by the method of Levenberg-Marquardt in Origin 8.0 software. The Baranyi model was applied to fit the growth curves by DMFit software.All the models were fitted to each individual growth curve satisfactorily with a highR2>0.99,then the primary model was established by the Logistic function with a higherR2.Ratkowsky model was used to fit the maximum specific growth rates and the lag time obtained by parameter estimation for the establishment of the secondary model.The growth parameters obtained from the Baranyi model were accurate and useful in fitting growth curves than other models. The secondary model had better fit withR2of 0.982 for the growth rate and 0.892 for the lag time.We developed primary and secondary models to predictSalmonellagrowth in egg yolk between 10 and 42 ℃.

egg yolk;Salmonella;predictive model

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.006

2016-03-07

國家自然科學(xué)基金(31230058)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-41-K23)

韓夢琪(1992—)，女，湖北宜昌人，研究方向：禽蛋蛋白質(zhì)抗菌機制；金永國(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：jinyongguo@mail.hzau.edu.cn

TS201.3

A

1672-3678(2016)06-0029-06