何 媛(九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江 332000)

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類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Th17/Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子的研究

何 媛(九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 九江 332000)

目的 探討外周血輔助性T細(xì)胞17(Th17)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及血清中相關(guān)細(xì)胞因子白介素-17(IL-17)、白介素-6(IL-6)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中的作用。方法選取71例RA患者(RA組)和40例健康受試者(對(duì)照組)，其中RA患者按照疾病活動(dòng)度DAS28積分分為低度(2.65.1,30例)活動(dòng)期RA組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17、Treg百分?jǐn)?shù)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)血清中IL-17、IL-6和TGF-β1水平。結(jié)果和對(duì)照組相比，RA患者外周血Th17占CD4+T細(xì)胞比例、Th17/Treg比值和血清IL-17、IL-6水平均升高(均P<0.05)，外周血Treg占CD4+T細(xì)胞比例和血清TGF-β1水平均降低(均P<0.05)。RA組患者外周血Th17占CD4+T細(xì)胞比例、Th17/Treg比值和血清IL-17、IL-6水平：高度活動(dòng)期RA組>中度活動(dòng)期RA組>低度活動(dòng)期RA組(均P<0.05)；RA患者外周血Treg占CD4+T細(xì)胞比例和血清TGF-β1水平：高度活動(dòng)期RA組<中度活動(dòng)期RA組<低度活動(dòng)期RA組(均P<0.05)。Th17、IL-17、Th17/Treg、IL-6與DAS28積分均呈正相關(guān)(r=0.701、0.632、0.439、0.516,均P<0.05),Treg、TGF-β1與DAS28積分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.436、-0.388，均P<0.05)。結(jié)論Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的異常變化與RA患者疾病程度密切相關(guān)，提示Th17/Treg失衡在RA的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎； 輔助性T細(xì)胞17； 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 白介素-17； 白介素-6； 轉(zhuǎn)化生長因子β1

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種系統(tǒng)性的自身免疫性疾病。主要臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎、大小關(guān)節(jié)滑膜的炎性反應(yīng)、伴或不伴晨僵，具有較高的發(fā)病率和致殘率。RA病因和發(fā)病機(jī)制目前并不非常清楚，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和輔助性T細(xì)胞(主要是Th17細(xì)胞)免疫調(diào)節(jié)異常在其發(fā)病機(jī)制中的作用成為研究熱點(diǎn)。本研究通過分析Th17、Treg及相關(guān)細(xì)胞因子在RA患者中的變化，探討兩者在RA發(fā)病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選自2013年3月至2015年12月九江學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院的RA患者71例(RA組)，其中男20例，女51例，年齡29～82歲，平均(52.5±11.5)歲，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)2009年ACR/EULAR的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，并排除心、腎、肺、肝等器質(zhì)性疾病和糖尿病、高血壓病、各種腫瘤、炎癥和其他一些自身免疫性疾病。RA患者按照疾病活動(dòng)度DAS28積分進(jìn)行分組，分為低度(2.65.1,30例)活動(dòng)期RA組。對(duì)照組40例，其中男17例，女23例，年齡31～83歲，平均(50.0±9.1)歲，為同期本院體檢中心接受體檢的健康成年人，經(jīng)體檢排除心、腎、肺、肝等器質(zhì)性疾病和糖尿病、高血壓病、各種腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病。所有受試者在研究前3個(gè)月均未服用過任何免疫抑制劑及激素。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀(美國BD公司生產(chǎn))，ST-360洗板機(jī)和酶標(biāo)儀(均為上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))。

1.2.2 主要試劑

CD3-FITC、CD4-PC5、PE-IL-17、CD4-FITC、CD25-PC5及固定破膜劑購自美國BD公司，白介素-17(IL-17)、白介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)酶聯(lián)試劑為美國GBD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集

所有待測(cè)者清晨空腹抽靜脈血3 mL，血液凝固后在抽血當(dāng)日于3000 r·min-1離心5 min，取出血清-80 ℃保存，用于檢測(cè)IL-17、IL-6、TGF-β1；另取空腹抗凝靜脈血2 mL，抗凝劑為EDTA-K2，用于檢測(cè)Th17和Treg。

1.3.2 檢測(cè)方法

1)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的流式檢測(cè)：分離出外周血單核細(xì)胞，在分離好的單核細(xì)胞及對(duì)照組中加入CD3和CD4的酶標(biāo)抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，用于Th17細(xì)胞的標(biāo)記；同時(shí)取外周全血200 μL及對(duì)照組加入CD4和CD25的單抗，混勻避光孵育20 min。孵育好的全血樣本PBS洗滌后，進(jìn)行固定破膜。最后加入酶標(biāo)Foxp3抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記，對(duì)照管加入FoxP3對(duì)照抗體，孵育30 min。而孵育后的PBMCs標(biāo)本用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，并加入到特殊培養(yǎng)液中(含新生牛血清、刺激劑、莫能霉素和離子霉素)，放入37 ℃溫箱孵育18～20 h。培養(yǎng)后的細(xì)胞及對(duì)照組同樣進(jìn)行固定破膜之后加入酶標(biāo)IL-17抗體和對(duì)照抗體，孵育30 min 后PBS洗滌。最后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，采用BD Cell Quest軟件分析測(cè)定Th17/Treg的比值。

2)IL-17、IL-6、TGF-β1的檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，經(jīng)LG10對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)系數(shù)采用Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Th17、Treg占CD4+T細(xì)胞比例的比較

和對(duì)照組相比，RA組患者外周血Th17占CD4+T細(xì)胞比例和Th17/Treg比值均升高，外周血Treg占CD4+T細(xì)胞比例下降(均P<0.05)；RA組患者外周血Th17占CD4+T細(xì)胞比例和Th17/Treg比值：高度活動(dòng)期RA組>中度活動(dòng)期RA組>低度活動(dòng)期RA組(均P<0.05)。RA患者外周血Treg占CD4+T細(xì)胞比例：高度活動(dòng)期RA組<中度活動(dòng)期RA組<低度活動(dòng)期RA組(均P<0.05)，見表1。

2.2 各組血清細(xì)胞因子的比較

和對(duì)照組相比，RA患者血清IL-17、IL-6水平均升高，血清TGF-β1水平降低 (均P<0.05)。RA組患者血清IL-17、IL-6水平：高度活動(dòng)期RA組>中度活動(dòng)期RA組>低度活動(dòng)期RA組；血清TGF-β1水平：高度活動(dòng)期RA組<中度活動(dòng)期RA組<低度活動(dòng)期RA組(均P<0.05)。見表2。

表1 各組外周血Th17、Treg占CD4+T細(xì)胞比例的比較

表2 各組血清細(xì)胞因子的比較

2.3 各指標(biāo)與DAS28的相關(guān)性分析

Th17、IL-17、Th17/Treg、IL-6與DAS28積分均呈正相關(guān)(r=0.701、0.632、0.439、0.516,均P<0.05),Treg、TGF-β1與DAS28積分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.436、-0.388，均P<0.05)。

3 討論

RA的發(fā)病與免疫復(fù)合物形成和炎性細(xì)胞浸潤有關(guān)，屬于一種自身免疫性疾病。Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群，屬于輔助性T細(xì)胞，可分泌IL-17、IL-22、IL-21、IL-6等多種相關(guān)細(xì)胞因子，具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的功能[2-3]。而IL-17是Th17分泌的最主要細(xì)胞因子，可通過介導(dǎo)中性粒細(xì)胞促進(jìn)前炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)趨化因子、促炎細(xì)胞因子(如IL-6、TNF)和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),引起組織細(xì)胞侵潤與破壞。IL-17可存在于RA患者的血清和關(guān)節(jié)液中，有報(bào)道[4]說RA患者滑膜液中IL-17表達(dá)與疾病的進(jìn)展和嚴(yán)重性相關(guān)。周潔如等[5]研究發(fā)現(xiàn)，和健康對(duì)照組相比，未經(jīng)治療的活動(dòng)期RA患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量升高。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Th17占CD4+T細(xì)胞比例和血清IL-17水平高于對(duì)照組，DAS28得分高組,兩指標(biāo)亦高于得分低組，同時(shí)Th17百分?jǐn)?shù)和IL-17均與DAS28得分呈正相關(guān)(r=0.701、0.632，P<0.05)。提示Th17細(xì)胞參與了RA疾病的發(fā)生和發(fā)展。

Treg是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，可阻止自身免疫性疾病產(chǎn)生，此外，可限制免疫防御中T、B細(xì)胞過度活化，避免組織損傷[6]。Treg細(xì)胞的功能缺陷或數(shù)量減少，可導(dǎo)致多種自身免疫性疾病。在本研究中，RA組Treg的百分?jǐn)?shù)比對(duì)照組低，這與趙俊桃[7]的研究相符。本研究還發(fā)現(xiàn)處于活動(dòng)性越強(qiáng)的RA患者Treg百分?jǐn)?shù)比活動(dòng)性較弱的RA患者更低，Treg百分?jǐn)?shù)與DAS28得分呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.436，P<0.05)。提示Treg與RA的病程發(fā)展相關(guān)，可通過檢測(cè)外周血Treg的數(shù)量來監(jiān)測(cè)RA疾病活動(dòng)性和嚴(yán)重性。

Th17可介導(dǎo)促炎反應(yīng)并促進(jìn)自身免疫性疾病發(fā)生，但Treg具有抗炎反應(yīng)和維持機(jī)體自身免疫耐受的功能。兩者只有維持動(dòng)態(tài)平衡，才能保證機(jī)體處于免疫穩(wěn)態(tài)。在多種自身免疫性疾病中，Th17/Treg失衡發(fā)揮了重要作用[8]。本研究結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，Th17/Treg比值升高，并且隨著RA疾病活動(dòng)性增強(qiáng)，比值增加也更明顯，說明Th17/Treg失衡也更顯著。Th17/Treg比值與DAS28得分呈正相關(guān)(r=0.439，P<0.05)。說明Th17/Treg失衡參與了RA的免疫應(yīng)答過程，并且和RA疾病活動(dòng)性相關(guān)。

IL-6生物活性廣泛，可刺激B淋巴細(xì)胞合成自身抗體，并促進(jìn)RF等其他細(xì)胞因子的合成，從而使關(guān)節(jié)軟骨組織病變加重，加快炎癥反應(yīng)進(jìn)程。有報(bào)道[9]稱IL-6可預(yù)測(cè)早期RA患者持續(xù)性骨質(zhì)破壞。TGF-β1作為一種多能細(xì)胞因子，具有拮抗炎癥因子的致炎作用，抑制免疫反應(yīng)。荊炳霞等[10]檢測(cè)緩解期和活動(dòng)期RA 2組患者的TGF-β1，發(fā)現(xiàn)這2組的TGF-β1水平比對(duì)照組要高，可幫助了解RA患者的病情。Th17細(xì)胞的啟動(dòng)和分化依賴于TGF-β1和IL-6，當(dāng)機(jī)體處于無炎癥損傷狀態(tài)時(shí)，缺乏IL-6，單獨(dú)存在的TGF-β1抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生，從而維持機(jī)體免疫耐受功能。故Th17和Treg在TGF-β1和IL-6兩者作用下，相互抑制。在本研究中，和對(duì)照組相比，RA組IL-6水平升高，TGF-β1水平下降。按照DAS28積分分組，IL-6水平變化為高度活動(dòng)期RA組>中度活動(dòng)期RA組>低度活動(dòng)期RA組，而TGF-β1水平變化正好相反。與DAS28得分相關(guān)性分析顯示，IL-6呈正相關(guān)，TGF-β1呈負(fù)相關(guān)。提示IL-6和TGF-β1參與RA疾病的活動(dòng)。

綜上所述，Th17、Treg的百分?jǐn)?shù)異常和Th17/Treg的失衡，參與了RA的發(fā)生和疾病的活動(dòng)，提示在RA發(fā)病機(jī)制中，CD4+細(xì)胞不同亞群功能紊亂發(fā)揮了重要作用。深入研究Th17相關(guān)細(xì)胞因子和Treg等CD4+細(xì)胞不同亞群之間的聯(lián)系，有助于RA發(fā)病機(jī)制的闡明和疾病活動(dòng)性的監(jiān)測(cè)。

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(責(zé)任編輯：鐘榮梅)

2016-05-07

R593.22

A

1009-8194(2016)09-0017-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2016.09.006