方旭明，漆偉男，張安妮，劉芳

經(jīng)顱電刺激對血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的改善作用及機制探討

方旭明1，漆偉男2，張安妮1，劉芳1

目的：探討經(jīng)顱電刺激治療（TES）對血管性癡呆（VD）大鼠認(rèn)知功能及海馬CA1區(qū)乙酰膽堿酯酶（AChE）及NR2B蛋白表達(dá)的影響。方法：SD大鼠90只隨機分為正常組、假手術(shù)組、模型組及TES低、中、高電壓組，各15只。后4組采用“2血管阻斷+硝普鈉降壓”法制作VD模型，各治療組分別給予電壓為500V、1 000V、1 500V的TES治療，3次/日，14 d/療程，共2個療程。水迷宮實驗檢測各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠海馬CA1區(qū)AchE及NR2B蛋白表達(dá)。結(jié)果：造模結(jié)束后7 d，造模大鼠的逃避潛伏期顯著長于正常組、假手術(shù)組（P＜0.01）。治療后，模型組，TES低、中、高電壓組穿越原平臺次數(shù)少于正常組及假手術(shù)組（P＜0.05或0.01），平均逃避潛伏期長于正常組及假手術(shù)組（P＜0.05或0.01）；TES低、中、高電壓組穿越原平臺次數(shù)多于模型組（P＜0.05），TES中、高電壓組平均逃避潛伏期短于模型組（P＜0.05）。模型組，TES低、中、高電壓組AchE及NR2B蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05）；TES中、高電壓組AchE及NR2B蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論：TES治療可改善VD大鼠的認(rèn)知功能，作用機制可能與減少海馬區(qū)AChE及NR2B蛋白表達(dá)有關(guān)。

血管性癡呆；經(jīng)顱電刺激；乙酰膽堿酯酶；N-甲基-D-天冬氨酸-2B受體

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是腦血管病導(dǎo)致腦損害所引起的獲得性智力障礙的一種臨床綜合征，是導(dǎo)致老年人癡呆的第2大病因[l]。其可能的分子機制有：膽堿能系統(tǒng)受損機制、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性機制等[2-4]。興奮性氨基酸受體過度激活引起的神經(jīng)元細(xì)胞死亡是腦缺血致組織損傷的重要促發(fā)者和介導(dǎo)者[5]。N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）是興奮性氨基酸受體之一，NR2B是NMDA受體的調(diào)節(jié)亞單位，在學(xué)習(xí)和記憶中起關(guān)鍵作用[6]。我科既往研究顯示，經(jīng)顱電刺激（transcranial electrical stimulation，TES）治療可促進急性期腦卒中患者運動功能的恢復(fù)[7]；亦有研究表明TES能改善卒中患者的工作記憶力[8]。本研究應(yīng)用TES治療VD大鼠模型，觀察TES對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，并探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔2級4月齡SD（Sprague-Dawley）大鼠90只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，由貴陽醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。

1.1.2 主要試劑與材料 兔抗大鼠乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）多克隆抗體及兔抗大鼠NR2B多克隆抗體均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及動物模型制備 通過水迷宮測試選取學(xué)習(xí)記憶能力相近的SD大鼠60只用于造模，納入模型組、TES低電壓組、TES中電壓組、TES高電壓組，各15只；剩余30只分為正常組和假手術(shù)組，各15只。參照文獻(xiàn)方法[9,10]采用“2血管阻斷+硝普鈉降壓法”制備VD大鼠模型。假手術(shù)組僅暴露分離雙側(cè)頸總動脈，不注射硝普鈉，予腹腔注射相當(dāng)量的生理鹽水。術(shù)中保暖、術(shù)后抗感染。術(shù)后第7天做Morris水迷宮實驗，以正常組大鼠逃避潛伏期的均值為參考值，（平均逃避潛伏期-參考值）/平均逃避潛伏期×100%＞20%，定義為VD大鼠。

1.2.2 治療方法 造模成功后第8天進行TES治療。腦定位儀確定顳葉、海馬區(qū)，采用CCS-1型大腦皮質(zhì)電刺激儀，刺激電極為圓形，直徑0.5 cm，陰、陽極間距1.5 cm。頭皮刺激時，陽極置于頭皮大鼠雙眼腦間到人字縫處相應(yīng)的雙側(cè)海馬區(qū)，陰極置于正前方，刺激脈寬50 μs，刺激頻率0.25 Hz，電壓分別為500 V（TES低電壓組）、1 000V（TES中電壓組）、1 500V（TES高電壓組）的窄高壓方波刺激，連續(xù)刺激3次/d，14 d/療程，休息1 d后繼續(xù)治療，共治療2個療程。

1.2.3 大鼠行為學(xué)檢測 治療結(jié)束后，使用Morris水迷宮對各組大鼠進行學(xué)習(xí)記憶能力測試：定位航行試驗及空間探索試驗?？臻g探索試驗以2次穿越平臺位置次數(shù)的平均值作為該項指標(biāo)的測試成績。

1.2.4組織學(xué)檢測 實驗終點大鼠，復(fù)查水迷宮試驗后斷頭取腦，制作石蠟切片，片厚5μm。免疫組化采用標(biāo)準(zhǔn)SP法，DAB顯色，取海馬和齒狀回互包平面，檢測大鼠海馬CA1區(qū)AchE和NR2B免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元。AchE和NR2B主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色或棕褐色顆粒，少量定位在細(xì)胞核中。

采用Leica攝像顯微鏡采圖，每張切片的海馬CA1區(qū)分別隨機選取5個視野，400倍光鏡下計陽性細(xì)胞數(shù)，取其?

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠脫失、排除情況

造模后至實驗終點共死亡大鼠13只。實驗終點時正常組15只，假手術(shù)組14只，模型組12只，TES低、中、高電壓組分別12、13、11只。

2.2 水迷宮測試結(jié)果

造模結(jié)束后7 d，正常組（n=15）、假手術(shù)組（n=15）及造模大鼠（n=60）的逃避潛伏期分別為（63.28± 15.68）s、（65.54±13.26）s及（90.32±16.53）s，造模大鼠的逃避潛伏期顯著長于其他2組（P＜0.01）。

治療后，模型組，TES低、中、高電壓組穿越原平臺次數(shù)少于正常組及假手術(shù)組（P＜0.05或0.01），平均逃避潛伏期長于正常組及假手術(shù)組（P＜0.05或0.01）；TES低、中、高電壓組穿越原平臺次數(shù)多于模型組（P＜0.05），TES中、高電壓組平均逃避潛伏期短于模型組（P＜0.05）；見表1。

表1 治療后各組水迷宮測試結(jié)果（±s）

表1 治療后各組水迷宮測試結(jié)果（±s）

注：與正常組及假手術(shù)組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05

組別正常組假手術(shù)組模型組TES低電壓組TES中電壓組TES高電壓組只數(shù)15 14 12 12 13 11穿越原平臺次數(shù)/次3.5±1.26 3.3±1.27 1.02±0.36②1.79±1.28②③2.63±1.29①③2.65±1.40①③平均逃避潛伏期/s 62.12±15.90 63.84±14.05 86.25±13.53②82.31±14.84②74.11±14.51①③72.98±13.15①③

2.3 免疫組化染色結(jié)果

模型組，TES低、中、高電壓組AchE及NR2B蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05）；TES中、高電壓組AchE及NR2B蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)均低于模型組（P＜0.05），見表2，圖1，2。

表2 各組大鼠海馬AchE及NR2B蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較（個，±s）

表2 各組大鼠海馬AchE及NR2B蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較（個，±s）

注：與正常組及假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

分組正常組假手術(shù)組模型組TES低電壓組TES中電壓組TES高電壓組只數(shù)15 14 12 12 13 11 AchE 18.04±2.20 19.28±5.80 54.20±8.30①52.88±8.67①38.48±8.69①②20.52±1.83①②NR2B 7.20±2.35 7.16±2.40 68.80±4.20①57.00±7.24①42.81±5.42①②36.42±3.45①②

圖1 正常組（A）、假手術(shù)組（B）、模型組（C）、TES低電壓組（D）、TES中電壓組（E）及TES高電壓組（F）AchE蛋白免疫組化染色結(jié)果（光學(xué)顯微鏡，×400）

3 討論

研究表明TES治療可明顯減輕急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損，提高日常生活能力[11]，經(jīng)顱磁刺激可改善VD大鼠的認(rèn)知功能[4]，但尚未見有關(guān)TES治療能否改善其認(rèn)知功能的報道。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠均出現(xiàn)水迷宮平均潛伏期延長，穿越原平臺次數(shù)減少，表明學(xué)習(xí)記憶能力下降，造模成功。通過TES治療，治療組大鼠水迷宮試驗平均潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)明顯增多；TES高、中電壓組平均潛伏期較低電壓組平均潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增加。提示TES治療可能有助于改善VD大鼠的空間記憶，且治療效果與電壓強度可能有一定的關(guān)系。

圖2 正常組（A）、假手術(shù)組（B）、模型組（C）、TES低電壓組（D）、TES中電壓組（E）及TES高電壓組（F）NR2B蛋白免疫組化染色結(jié)果（光學(xué)顯微鏡，×400）

海馬CA1區(qū)是信息加工、整合、強化、傳遞的重要區(qū)域，與膽堿能系統(tǒng)密切相關(guān)。有學(xué)者提出中樞膽堿能突觸是記憶的結(jié)構(gòu)和生理學(xué)基礎(chǔ)，腦內(nèi)Ach是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切的一種神經(jīng)遞質(zhì)[12]。腦組織內(nèi)的Ach含量可作為膽堿能結(jié)構(gòu)和功能的一項特異性指標(biāo)。AchE是Ach的降解酶，測定海馬CA1區(qū)中AchE表達(dá)，可間接判斷海馬CA1區(qū)Ach含量的變化。本研究中TES治療組大鼠AchE蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組下降，以高、中電壓組明顯，提示TES治療可降低大鼠海馬AchE活性降低，從而增加Ach含量，表現(xiàn)出大鼠學(xué)習(xí)記憶能力提高。Tayebati等[13]研究發(fā)現(xiàn)，抑制海馬組織Ach的分解，增加海馬組織Ach的含量，使VD模型大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞增加，其結(jié)果有利于模型大鼠學(xué)習(xí)能力的改善，該結(jié)果與本研究相似。

NR2B影響NMDAR的結(jié)構(gòu)和功能，是最重要的調(diào)節(jié)亞單位結(jié)構(gòu)，與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最為密切，甚至被稱為“記憶基因”[14]。敲除NR2B的小鼠，NMDAR反應(yīng)性下降，NMDAR依賴的長時程增強喪失，小鼠空間學(xué)習(xí)能力受損[15]。在缺血缺氧后，NR2B表達(dá)增加，NMDAR過度興奮，對神經(jīng)的毒性增強[16]。本研究中TES治療組大鼠NR2B蛋白的陽性細(xì)胞表達(dá)較模型組下降，尤以高、中電壓組下降明顯，提示通過TES治療VD大鼠，可使大鼠海馬NR2B活性降低，達(dá)到抑制NMDAR過度興奮，減少對神經(jīng)元的神經(jīng)毒性作用。

本實驗提示TES治療可改善VD大鼠的認(rèn)知功能，其療效與治療的電壓有一定關(guān)系。推測作用機制可能與減少海馬區(qū)AchE及NMDAR陽性細(xì)胞表達(dá)有關(guān)。在以后的進一步研究中，如果有western blot結(jié)果的支持，則本試驗的結(jié)論更有意義。

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（本文編輯：唐穎馨）

Effect of Transcranial Electrical Stimulation on the Cognitive Function of Vascular Dementia Rats

FANG Xu-ming1,QI Wei-nan2,ZHANG An-ni1，LIU Fang1.1.Department of Neurology,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004；2.Department of Neurology,The People’s Hospital of Yichun City,Jiangxi 336000

Objective：To study the effects of transcranial electrical stimulation(TES)on cognitive function of rats with vascular dementia(VD)and the expressions of acetylcholinesterase(AchE)and NR2B protein in the hippocampal CAl region.Methods：Ninety SD rats were randomly divided into normal group，sham-operated group，VD group and low-,middle-and high-voltage TES treated groups(n=15 for each group).“Two-vesssel-occlusion plus sodium nitroprusside method”was used to induce VD model.TES with different voltages(500,1 000 and 1 500V)were applied to the TES treated groups.AchE and NR2B protein were assayed by immunohistochemistry analysis in the hippocampal CA1 region.The capabilities of learning and memory were tested by Morris water maze.Results：The escape latency(EL)in the VD group and low-,middle-and high-voltage TES treated groups were significantly longer than those in both the normal and sham-operated groups(P＜0.01).After treatment,the times across the platform in the VD group and low-,middle-and high-voltage TES treated groups were significantly fewer and the EL were longer than those in both the normal and sham-operated groups(P＜0.05 or 0.01).The times across the platform of low-,middle-and high-voltage TES treated groups were more than those of the VD group(P＜0.05).The EL of middle-and high-voltage TES treated groups were statistically shorter than that of the VD group(P＜0.05).The numbers of AchE and NR2B positive cells in VD group and low-,middleand high-voltage TES treated groups were statistically numerous than those of the normal and sham-operated groups(P＜0.05).The numbers of AchE and NR2B positive cells in middle-and high-voltage TES treated groups were much less than those of the VD groups(P＜0.05).Conclusion：TES help to improve the cognitive ability of VD rats,probably by way of decreasing the AchE and NR2B protein expression in hippocampal CA1 region.

vascular dementia；transcranial electrical stimulation,Acetylcholinesterase；N-methyl-D-aspartic acid receptor 2B

R741；R741.02；R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.05.002

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)科貴陽 550004 2.江西宜春市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科江西 宜春 336000

貴州省科技廳黔科合J字[2011]2236

2015-07-03

劉芳liufang_c@126.com