徐姣，劉揚，潘鄧記，楊園，張函，熊穎，張強

·論著·

RNAi技術沉默星形膠質細胞Adam10基因模型的建立

徐姣a，劉揚b，潘鄧記a，楊園a，張函a，熊穎c，張強a

目的：建立離體星形膠質細胞Adam10基因沉默模型。方法：體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠星形膠質細胞，采用免疫熒光方法標記膠質纖維酸性蛋白（GFAP）以鑒定星形膠質細胞及其純度。通過RNA干擾（RNAi）技術，使用轉染試劑Lipofectamine2000將靶向作用于大鼠Adam10基因的siRNA序列轉染至星形膠質細胞內，通過Real time-PCR和Western blotting技術在RNA水平和蛋白水平檢測沉默效率。結果：靶向作用于星形膠質細胞Adam10基因的siRNA序列成功轉染入星形膠質細胞，并且轉染Adam10基因靶向干擾序列的星形膠質細胞Adam10基因的表達在RNA水平和蛋白水平較陰性對照組明顯降低（P＜0.05）。結論：可以通過RNAi技術建立離體星形膠質細胞Adam10基因沉默模型。

星形膠質細胞；Adam10基因；RNA干擾

ADAMs（a disintegrin and metalloprotease）是I型跨膜蛋白，因其結構上具有解聚素（disintegrin）和金屬蛋白酶（metalloprotease）二個重要的結構域而命名[1]。ADAM10表達于星形膠質細胞、少突膠質細胞、部分正在分化的大腦皮質細胞和神經元細胞[2]。ADAM10是ADAMs家族的一個亞型，其作用底物很廣泛，目前已發(fā)現的包括Notch[3]、Cadherin[4,5]、Ephrin[6]、APP[7,8]等30余種跨膜蛋白質，這些底物分子在中樞神經系統(tǒng)中均具有重要作用[9-12]。已有研究表明，Adam10基因敲除小鼠因心血管系統(tǒng)發(fā)育紊亂于胚胎第9.5 d即死亡，并出現體節(jié)和中樞神經系統(tǒng)發(fā)育異常[13]。選擇性敲除小鼠神經干細胞的Adam10基因，小鼠大腦皮質發(fā)育出現異常，主要表現為神經元的分化和遷移異常[14]。Adam10基因缺失導致海馬和皮質組織中膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和CaMKⅡα的mRNA、蛋白質表達水平增高，導致膠質細胞增多，造成神經元丟失和功能抑制[15]。但ADAM10干預上述底物分子的功能和活性，進而影響突觸可塑性和神經網絡功能重建的具體作用機制尚待進一步闡明。近年來，多種研究證明RNA干擾（RNA interfering，RNAi）技術靶向沉默Adam10基因對心肌細胞、腫瘤細胞的生物學活性有著重要影響。本研究嘗試過RNAi技術靶向沉默離體星形膠質細胞Adam10基因，以研究星形膠質細胞在Adam10基因低表達情況下生物學功能的變化，為后續(xù)實驗研究建立離體細胞培養(yǎng)模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生24 h內的SPF級SD大鼠乳鼠，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 ①Adam10siRNA干擾序列：按照RNAi實驗原理和siRNA設計原則，設計3種靶向作用于Adam10基因的干擾序列為目的siRNA，分別命名為Si-r-Adam10-001、Si-r-Adam10-002、Si-r-Adam10-003（表1）；1種與以上目的siRNA序列有相同堿基組分，但堿基排列順序不同，與Adam10無同源性的序列作為陰性對照序列；1種與Adam10無同源性的熒光標記（cy3）的陰性對照序列，由于此序列帶熒光，可以在熒光顯微鏡下觀察序列在轉染試劑的作用下是否被轉入細胞內，直觀地評價轉染效率。序列設計完成后，由廣州銳博生物有限公司合成。②轉染試劑Lipofectamine2000（購于美國Invitrogen公司），小鼠抗大鼠GFAP單克隆抗體（購于美國CST公司），小鼠抗大鼠ADAM10單克隆抗體（購于美國Santa Cruz公司），FITC標記羊抗小鼠IgG、HRP標記兔抗小鼠IgG（購于美國Jackson ImmunoResearch實驗室），Trizo（l購于北京Aidlab公司），M-MLV Reverse Transcriptase（購于美國GeneCopoeia公司），qPCR Mix（購于美國GeneCopoeia公司）。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質細胞原代培養(yǎng)和傳代 取出生24 h內的SD大鼠乳鼠大腦，小心去除腦膜及血管，取皮質組織置于無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，剪碎，0.25%胰酶消化，用15%胎牛血清DMEM/F12細胞培養(yǎng)基中和胰酶 ，200目濾網濾過，4 ℃800 rpm離心8min后，用20%胎牛血清DMEM/F12細胞培養(yǎng)基重懸，種于細胞培養(yǎng)瓶內，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，每2～3 d換液，細胞密度至90%～100%時，進行細胞傳代以純化細胞。

1.2.2 星形膠質細胞鑒定 星形膠質細胞爬片，冰甲醇固定15 min，PBS洗5 min×3次，0.2%Triton X-100破膜15 min，PBS洗5 min×3次，5%BSA封閉1 h，PBS洗5 min×3次，小鼠源單克隆GFAP一抗4 ℃濕盒孵育過夜，PBS洗5 min×3次，FITC標記山羊抗小鼠IgG抗體避光室溫孵育1 h，PBS洗5 min×3次，DAPI染核8 min，PBS洗5 min×3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 細胞轉染 0.25%胰酶消化，15%胎牛血清DMEM/F12細胞培養(yǎng)基中和胰酶，4 ℃800rpm離心8 min，無血清Opti-MEM培養(yǎng)基重懸細胞，置于無酶離心管中以備用。用無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋siRNA和轉染試劑lipofectamin2000，置于無酶EP管中，室溫靜置5 min，將稀釋后的siRNA和lipofectamin2000輕輕混勻，室溫靜置20 min以形成siRNA/lipofectamin2000復合物，將siRNA/lipofectamin2000復合物加到盛有細胞的離心管中，輕輕搖勻，靜置5 min，將細胞種于12孔板內，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃，溫育6 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗1次，加入15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；通過轉染cy3標記陰性對照序列以檢測轉染效率。

表1 3種siRNA序列

表2 引物序列

1.2.4 實驗分組 細胞分為5組：SiT1組、SiT2組、SiT3組、NCSi組、Lipo組；星形膠質細胞體外轉染ADAM10-siRNA，分別有三組目的siRNA序列供篩選，即Si-r-Adam10-001（SiT1）、Si-r-Adam10-002（SiT2）、Si-r-Adam10-003（SiT3），對應分組為SiT1組、SiT2組、SiT3組，分別加入 SiT1/Lipofectamine2000、SiT2/Lipofectamine2000、SiT3/Lipofectamine2000復合物。由于Lipofectamine2000有一定的細胞毒性，故另設置Lipo組為對照組，只加入Lipofectamine2000，排除Lipofectamine2000對實驗的影響。設置NCSi組為陰性對照組，加入NC-siRNA/Lipofectamine2000復合物，NC-siRNA與目的siRNA序列有相同堿基組分，但堿基排列順序不同，與Adam10無同源性的序列，排除轉入堿基對細胞的影響。

1.2.5 Real time PCR檢測轉染效率 ①提取RNA：將6孔板內轉染24 h后的細胞，PBS洗3次，每孔加1 mL Trizol冰上吹打均勻，靜置5 min，4 ℃12 000rpm 5 min離心，留取上清；加入200 μL氯仿，充分顛倒搖勻，室溫靜置15 min，4 ℃12 000rpm 15 min離心；吸取上層水樣液體500 μL至無酶EP管中，加入500 μL異丙醇（1∶1），用力搖勻，室溫靜置10 min；4 ℃12 000 rpm 10 min離心；棄上清，加入75%乙醇1 mL（無水乙醇用DEPC水配置），震蕩均勻，8 000 rpm 5 min離心；棄去上清液，用濾紙吸干EP管中RNA水分，加入適量DEPC水溶解EP管中RNA。②RNA純度及濃度測定：取溶解后的RNA 1 μL用DEPC水稀釋200倍后，用紫外分光光度計測定OD260、OD280以及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度。根據OD260/OD280比值，估測RNA質量，比值在1.8～2.0滿足實驗要求。吸光光度值按下列公式計算樣品RNA的濃度：總RNA濃度（μg/μL）=OD260值×40×200×10-3。將總RNA放于－80 ℃冰箱內保存以備用。③RNA逆轉錄：把RNA在65 條件下反應5 min后，立即放于冰上冷卻使其變性，依次加入2 μL 5×RT Buffer，0.5 μL RT Enzyme Mix，0.5 μL Primer Mix，1 μg RNA，加Nnase free water定容至10 μL體系；在37 條件下，進行15 min的逆轉錄反應；在98 ℃條件下進行5 min的酶失活反應，反應結束后將cDNA置于－20 ℃條件下保存。④Real Time-PCR：依次加入10 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物（表2），2 μL cDNA樣品，6.4 μL蒸餾水；設置PCR反應程序：95 →5 s，55 →10 s，72 →5 s；根據擴增曲線數據，最終數據以2-△△Ct進行分析，計算ADAM10相對表達量。

1.2.6 Western Blotting檢測ADAM10蛋白的表達 轉染72 h后RIPA法提取各組細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。32 μg總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，350mA 2 h轉至NC膜，NC膜經5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h后，小鼠源抗大鼠ADAM10抗體（1∶500）4﹣孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次后，HRP標記兔抗小鼠二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，用TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光液化學發(fā)光后采集圖像，Gene Genius Bio-Imaging system凝膠成像分析系統(tǒng)結合Image J軟件采集并分析圖像。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS13.0軟件包分析數據，計量資料以（均數±標準差）表示，組間差異行單因素方差分析后采用Tukey’s post hoc test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 星形膠質細胞體外培養(yǎng)鑒定結果

SD大鼠乳鼠體外星形膠質細胞原代培養(yǎng)24 h后，鏡下可見細胞貼壁良好，細胞呈梭形或圓形，細胞折光性較差，細胞體較小，細胞培養(yǎng)瓶中可見少量死細胞和細胞碎片；待細胞培養(yǎng)至3～4 d時，可見細胞貼壁牢固，細胞體變大，伸出多處指狀突起，折光性增強；待細胞培養(yǎng)至5～6 d時，星形膠質細胞呈星狀，進一步培養(yǎng)至細胞融合時傳代。傳代后得到純化的星形膠質細胞（F1代），F1代星形膠質細胞呈不規(guī)則形，邊界清晰，細胞體豐滿扁平，細胞間彼此連接，折光性強，當星形膠質細胞長滿至80%～90%時，即可用于實驗。將F1代星形膠質細胞傳代至多聚賴氨酸包被好的12孔板中，當細胞密度約為50%～60%時，對細胞進行GFAP及DAPI免疫熒光染色（圖1A），用于鑒定星形膠質細胞純度，鑒定結果提示F1代星形膠質細胞純度＞95%。

2.2 星形膠質細胞體外轉染Adam10-siRNA

培養(yǎng)細胞至對數增長期，向細胞內加入Cy3-siRNA/lipofectamin2000復合物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，固定細胞，免疫熒光染色。藍色熒光標記細胞核，紅色熒光標記轉染序列。Cy3標記siRNA轉染入星形膠質細胞，包繞細胞核周圍（圖1B），提示siRNA組轉染成功，轉染效率為95%，后續(xù)實驗用轉染Cy3-siRNA同樣的方法進行轉染。

2.3 ADAM10-siRNA沉默效率

通過Western blotting、Real time-PCR篩選最有效沉默星形膠質細胞Adam10基因的序列。Western Blotting結果示，SiT1序列在蛋白水平沉默效率最大，與NCSi組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2A）；Real time-PCR結果示，SiT1在RNA水平沉默效率最大，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2B）；后續(xù)實驗可選擇SiT1為靶向干擾序列。

3 討論

ADAM10是一種大約由750個氨基酸組成的I型跨膜蛋白質，具有一個大的膜外結構域、一個跨膜結構域和一個富含脯氨酸的細胞質結構域，膜外結構域由幾種不同的功能結構域組成[16]。ADAM10底物眾多，在神經系統(tǒng)發(fā)育中不僅起到調節(jié)細胞增殖、遷移、分化的作用，還參與軸突生長和髓鞘化[17,18]，但ADAM10在上述過程中的分子細胞學機制尚待闡明。為了進一步研究Adam10在中樞神經系統(tǒng)分化發(fā)育和病理過程中的具體機制，近年來人們嘗試通過基因工程學的方法建立干擾Adam10基因表達模型。前期研究發(fā)現，Adam10常規(guī)基因全敲除小鼠由于嚴重的心腦等器官缺陷而夭折于胚胎發(fā)育早期，而不能獲得成年Adam10基因敲除小鼠進行研究。為了解決這一問題，本實驗嘗試通過RNAi技術建立離體星形膠質細胞選擇性Adam10基因沉默模型，達到沉默Adam10基因的作用，為后續(xù)實驗研究提供研究工具。

圖1 星形膠質細胞鑒定及體外轉染Adam10-siRNA（免疫熒光染色，×400）

圖2 轉染SiRNA后的Western blotting和Real time PCR結果

為了能建立離體星形膠質細胞Adam10基因沉默模型，首先需要獲得高純度離體培養(yǎng)的星形膠質細胞。早期發(fā)育過程中，神經元與膠質細胞的增殖高峰期不同，神經元增殖在胚胎期完成，而神經膠質細胞的大量增殖卻發(fā)生在胚胎晚期和出生后[19]。因此，本實驗取出生后24 h內的新生大鼠大腦皮質細胞，目的是分離獲得更多的星形膠質細胞。在取得乳鼠大腦皮質細胞前，用軟頭毛筆小心去除所有腦膜和血管，旨在減少成纖維細胞。鑒于成纖維細胞貼壁速度較星形膠質細胞快，采用差速貼壁培養(yǎng)方法獲得純度更高的星形膠質細胞。即原代和傳代培養(yǎng)星形膠質細胞時，將離心重懸后獲得的細胞懸液置于培養(yǎng)瓶內，于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)15 min后，輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，將上清液移至另一培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，從而去除成纖維成分。由于星形膠質細胞的增殖速度遠大于少突膠質細胞和其它神經細胞，而且星形細胞與其它細胞分層生長，星形細胞在底層，經過一定力度的搖動處理，可選擇性地使在星形細胞上層生長的細胞脫落。因此，在星形膠質細胞傳代培養(yǎng)前，37 -200 r/min搖床18 h以去除少突膠質細胞和小膠質細胞，換液培養(yǎng)l d后傳代，以得到純對較高的星形膠質細胞，為實驗提供高純度的星形膠質細胞。

RNAi是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程。本研究按照siRNA干擾序列設計原則，設計對Adam10基因有沉默作用的序列，由于目前未發(fā)現siRNA的干擾效率與mRNA中具體位置的關系，為確保對mRNA的有效抑制，針對Adam10基因設計3條siRNA干擾序列，進行化學合成，并通過實驗篩選出沉默效率最高的siRNA序列，旨在獲得能有效抑制星形膠質細胞Adam10基因的siRNA序列。

本研究遵循RNAi實驗原則，通過轉染試劑lipofectamin2000，借助于Cy3標記陰性對照序列，不斷優(yōu)化轉染條件，保證轉染效率≥95%，按照轉染Cy3標記陰性對照序列的方法和實驗條件，將靶向作用于星形膠質細胞Adam10基因的siRNA序列成功轉入星形膠質細胞內。Real time-PCR檢測結果示，在RNA水平SiT1組ADAM10相對表達量較對照組最低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明SiT1序列對星形膠質細胞Adam10基因沉默效率最大。Western blotting檢測結果示，在蛋白水平SiT1組ADAM10表達量較對照組最低，同樣表明SiT1序列對星形膠質細胞Adam10基因沉默效率最大。

本研究通過RNAi技術成功建立離體星形膠質細胞Adam10基因沉默模型，并篩選出對星形膠質細胞Adam10基因沉默效率最大的序列，為后續(xù)研究Adam10基因對中樞神經系統(tǒng)的作用及機制奠定了基礎。

[1]Huovila AP,Turner AJ,Pelto-Huikko M,et al.Shedding light on ADAM metalloproteinases[J].Trends Biochem Sci,2005,30：413-422.

[2]Jorissen E,Prox J,Bernreuther C,et al.The Disintegrin/Metall-oproteinase ADAM10 is essential for the establishment of the brain cortex[J].J Neurosci,2010,30：4833-4844.

[3]Lieber T,Kidd S,Young MW.Kuzbanian-mediated cleavage of Drosophila Notch[J].Genes Dev,2002,16：209-221.

[4]Uemura K,Kihara T,Kuzuya A,et al.Characterization of sequential N-cadherinin cleavage by ADAM10 and PSI[J].Neurosci Lett,2006,402：278-283.

[5]Reiss K,Maretzky T,Ludwig A,et al.ADAM10 cleavage of N-cadherin and regulation of cell-cell adhesion and beta-catenin nuclear signalling[J].EMBO J,2005,24：742-752.

[6]Janes PW,Saha N,Barton WA,et al.Adam meets EPh：an ADAM aubatrate recognition modules acts as a molecular switch for ephrin cleavage in trans[J].Cell,2005,123：291-304.

[7]Marcinkiewicz M,Seidah NG.Coordinated expression of bete-amyloid precursor protein and the putative beta-secretase BACE and alphasecretase ADAM10 in mouse and human brain[J].J Neurochem,2000,75：2133-2143.

[8]Postina R,Schroeder A,Dewachter I,et al.A disintegrin-metalloproteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse model[J].J Clin Invest,2004,113：1456-1464.

[9]Yoon K,Gaiano N.Notch signaling in the mammalian central nervous system：insights from mouse mutants[J].Nat Neurosci,2005,8：709-715.

[10]Redies C.Cadherins in the central nervos system[J].Prog Neurobiol, 2000,61：611-648.

[11]Goldshmit Y,McLenachan S,Turnley A.Roles of Eph receptors and ephrins in the normal and damaged adult CNS[J].Brain Res Rev,2006,52：327-345.

[12]Thinakaran G,Koo EH.Amyloid precursor protein trafficking,processing,and function[J].J Biol Chem,2008,283：29615-29619.

[13]Hartmann D,de Strooper B,Serneels L,et al.The disintegrin/metalloprotease ADAM10 is essential for Notch signalling but not for alpha-secretase activity in fibroblasts[J].Hum Mol Genet,2002,11：2615-2624.

[14]Jorissen E,Prox J,Bernreuther C,et al.The disintegrin/metalloproteinase ADAM10 is essential for the establishment of the brain cortex[J].J Neurosci,2010,30：4833-4844.

[15]李朋.ADAM10缺失對CaMKⅡα基因表達，膠質細胞增殖及突觸可塑性的影響[D].福建：福建醫(yī)科大學,2014.

[16]Asai M,Hattori C,Szabó B,et al.Putative function of ADAM9,ADAM10,and ADAM17 as APP alpha-secretase[J].Biochem Biophys Res Commum,2003,301：231-235.

[17]Hooper NM,Turner AJ.The search for alpha-secretase and its potential as a therapeutic approach to Alzheimer disease[J].Curr Med Chen, 2002,9：1107-1119.

[18]Postina R,Schroeder A,Dewachter I,et al.A disintegrin-metalloproteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse modle[J].J Clin Invest,2004,113：1456-1464.

[19]Liberto CM,Albrecht PJ,Herx LM,et al.Pro-regenerative properties of cytokine-activated astrocytes[J].Neurochemistry,2004,89：1092-1100.

（本文編輯：王晶）

siRNA Interfering of Astrocytic Adam10 Gene Slience

XU Jiaoa,LIU Yangb,PAN Deng-jia,YANG Yua-na,ZHANG Hana,XIONG Yingc,ZHANG Qianga.a.Department of Neurology,b.Department of Neurosurgery, c.Department of Radiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China

Objective：To establish an in vitro model of Adam 10 gene silence in astrocytes by RNAi.Meth?ods：The purified astrocytes were isolated from neonatal SD rats cerebral cortex in fresh culture medium.The quality and purity of astrocytes were identified by glial fibrillary acidic protein(GFAP)staining.The Adam10 gene siRNA sequence were transfected to astrocytes via Lipofectamine2000.The silence efficiency was counted via examination of the relative expression RNA and protein level of Adam10by real time PCR and western blot respectively.Results：The Adam10 siRNA sequence was transfected into astrocytes successfully.The level of Adam10RNA and protein in RNAi group is significantly lower than that in control groups(P＜0.05).Conclu?sion：Adam10gene silencing model can be established by RNAi technology in vitro.

astrocyte；Adam10gene；RNA interfering

R741；R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.05.001

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院a.神經內科b.神經外科c.放射科武漢 430030

1.國家自然科學基金（No.81471230）2.國家自然科學基金（No.81571206）

2016-02-01

張強550251415@qq. com