黃 琳，劉逸寒，李明杰，李 瑞，郭 偉，桂 爽，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

枯草芽胞桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達(dá)及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

黃 琳，劉逸寒，李明杰，李 瑞，郭 偉，桂 爽，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

本文通過重疊PCR技術(shù)構(gòu)建獲得枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG)(BTG)重組基因Sprodbtg，該基因依次包含SD序列、谷氨酸棒桿菌信號(hào)肽ΔS0949序列、proD-BTG基因，并將該目的基因克隆入大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)載體pXMJ19中構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg．隨后，重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)重組菌株的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化．結(jié)果表明：重組菌株C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達(dá)重組酶原蛋白proD-BTG經(jīng)活化后，BTG的活力達(dá)到(41.23±2.01)U/L；在重組菌培養(yǎng)12 h后誘導(dǎo)、IPTG終濃度0.8 mmol/L、誘導(dǎo)40 h的最優(yōu)誘導(dǎo)條件下，BTG的活力達(dá)到最高，為(55.62±2.34)U/L，較優(yōu)化前提高了約 34.90%,．

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；谷氨酸棒桿菌；枯草芽胞桿菌；分泌表達(dá)；條件優(yōu)化

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TG)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)[1]．由于其安全、特有的交聯(lián)性質(zhì)，可用于改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，在植物蛋白制品、焙烤制品、魚、肉、乳類制品、固定化酶、可食性包裝等行業(yè)已有廣泛應(yīng)用[2-6]．

目前，僅茂源鏈霉菌(Streptomyces mobaraense)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTG)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，但茂源鏈霉菌生長(zhǎng)慢、發(fā)酵周期長(zhǎng)、酶活力收率低[7]，造成MTG價(jià)格較高；另外，隨著食品加工業(yè)種類逐漸增多，MTG的特性無法滿足一些食品加工底物和過程的需求，因此，亟需開發(fā)不同特性的TG．枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(BTG)是在1996年被Kobayashi等[8]首次發(fā)現(xiàn)，且經(jīng)驗(yàn)證BTG的分子結(jié)構(gòu)沒有信號(hào)肽和前肽；Suzuki等[9]發(fā)現(xiàn)BTG最適作用pH為8.2，最適作用溫度為60 ℃，可催化酪素液及BSA蛋白分子的凝膠化和交聯(lián)；并且，經(jīng)分析BTG和MTG在氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)上有很大區(qū)別，這為開發(fā)新型TG奠定了基礎(chǔ)．

本研究室在前期研究中從枯草芽胞桿菌(B. subtilis)168ATCC23857基因組克隆了BTG基因，該基因僅編碼成熟肽，對(duì)異源宿主細(xì)胞有毒性[10]，影響其正常生長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)BTG高效表達(dá)．研究發(fā)現(xiàn)，來自于生暗灰鏈霉菌(S．caniferus)的TG前肽proD對(duì)BTG活性的抑制率最高，達(dá)到70%[11]．然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)難以實(shí)現(xiàn)proD-BTG酶原的高效表達(dá)．谷氨酸棒狀桿菌蛋白分泌機(jī)制健全，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)便，使用安全，無致病性，是表達(dá)外源基因的良好受體菌，本研究室已利用谷氨酸棒桿菌表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了BTG的異源表達(dá)[12]．因此，基于上述研究，本文以谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032為宿主菌株，構(gòu)建重組菌株C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg以實(shí)現(xiàn)proD-BTG的高效分泌表達(dá)，并對(duì)其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為BTG的研究奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、谷氨酸棒狀桿菌(C．glutamicum)ATCC13032、大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pXMJ19和克隆有prodbtg基因的質(zhì)粒pET28a-prodbtg均為本實(shí)驗(yàn)室保藏．

1.1.2 酶與主要試劑

限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶、Probest高保真酶，TaKaRa公司；溶菌酶、RNase，上海生工生物工程有限公司；小量瓊脂糖凝膠DNA試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；蛋白胨和酵母浸粉，Oxoid公司；Factor Xa，Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純．

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，pH 7.0．

LA培養(yǎng)基：LB+2%,瓊脂粉，pH 7.0～7.2．

谷氨酸棒桿菌復(fù)蘇培養(yǎng)基：LB+0.5%,葡萄糖，pH 7.0～7.2．

谷氨酸棒桿菌產(chǎn)MTG培養(yǎng)基(MMTG)(g/L)：葡萄糖60，MgSO41，(NH4)2SO430，KH2PO41.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，鹽酸硫胺素4.5×10-4，生物素4.5×10-4，甲硫氨酸0.15，CaCO350，pH 7.5．

1.1.4 引物設(shè)計(jì)

為了使得外源蛋白在谷氨酸棒狀桿菌中實(shí)現(xiàn)高效分泌表達(dá)，設(shè)計(jì)含SD序列及C．glutamicum R來源的有高效分泌能力信號(hào)肽ΔS0949序列[13]的重組proD-BTG基因序列．依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則[12]設(shè)計(jì)引物. 上游引物P1：5′-TATCGGCGCTGCCAGCATGT TTATGCCAAAGGCCAACGCCCAAGGAGCACTCG AGGCCAGCGGCGGC-3′；P2：5′-CCCAAGCTT AAA GGAGGACACGCATGCAAATAAACCGCCGAGGCT TCTTAAAAGCCACCGCAGGACTTGCCACTATCG GCGCTGCCAGCATG-3′；下游引物R1：5′-CGCGG ATCC TTAGCGGACGATGCGG-3′．上游引物P1 5′端不含有酶切位點(diǎn)；上游引物P2 5′端含有HindⅢ酶切位點(diǎn)(AAGCTT)；下游引物R1 5′端含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)(GGATCC)．

1.2 方法

1.2.1 Sprodbtg基因的擴(kuò)增

通過重疊PCR將SD序列和信號(hào)肽ΔS0949序列克隆于proD-BTG基因的N端，獲得目的基因．第1輪PCR以質(zhì)粒pET28a-prodbtg為模板，以P1、R1為引物擴(kuò)增目的基因；第2輪PCR以第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以P2、R1為引物擴(kuò)增出最終目的基因含SD序列及ΔS0949 全長(zhǎng)序列的proD-BTG基因．PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min．

1.2.2 重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg的構(gòu)建

經(jīng)切膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物(Sprodbtg基因)及pXMJ19質(zhì)粒均用HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)純化后，用T4 DNA連接酶于16,℃連接過夜并轉(zhuǎn)化至E．coli JM109，然后涂布于含50 μg/mL氯霉素的平板，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證．將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-Sprodbtg．

1.2.3 重組菌株C．glutamicum ATCC13032/pXMJ 19-Sprodbtg的構(gòu)建

取6 μL 構(gòu)建好的質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg電轉(zhuǎn)化至C．glutamicum ATCC13032感受態(tài)細(xì)胞，電擊條件同挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組菌株命名為C．glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg．質(zhì)粒pXMJ19轉(zhuǎn)化子C．glutamicum ATCC13032/ pXMJ19作為對(duì)照菌株．

1.2.4 重組菌C. glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg及C. glutamicumATCC13032/pXMJ 19的誘導(dǎo)表達(dá)

分別挑取1環(huán)重組菌C．glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg或C．glutamicum ATCC 13032/pXMJ19單菌落，分別接種于裝有50,mL LB培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，30 ℃、200,r/min振蕩培養(yǎng)過夜，以1%,的接種量分別轉(zhuǎn)接于裝有100 mL MMTG的500 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12,h，加入終濃度為1,mmol/L的IPTG誘導(dǎo)酶原蛋白proD-BTG的表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h．分別取1 mL重組菌發(fā)酵液于12,000,r/min離心1,min，獲取上清液，向其中分別加入130 μL 100%, TCA，冰上放置30 min，12,000,r/min離心5,min，棄去上清液，加1,mL丙酮洗滌2次．待丙酮揮發(fā)完全后，沉淀分別溶解于20,μL無菌蒸餾水中，各加入5,μL 5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，沸水浴5,min，12,000,r/min離心10,min，分別取上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析．

1.2.5 酶原蛋白proD-BTG的酶活力測(cè)定[15]

含有酶原蛋白proD-BTG的發(fā)酵液通過4,000,r/min離心15,min回收上清液，一定量的Factor Xa加入到表達(dá)proD-BTG的重組谷氨酸棒桿菌上清液中切割重組蛋白．隨后通過熒光定量分析法分析酶原蛋白proD-BTG的酶活力．

酶活力檢測(cè)反應(yīng)體系：90,μL(5,mg/mL)的重組酶和1.98,mL 50,mmol/L Tris-HCl(pH,7.5)包括0.2%, N，N-二甲基酪蛋白，12.5,μmol/L 丹磺尸胺(MDC)，4.5,mmol/L DTT．反應(yīng)體系于37,℃反應(yīng)30,min，加入42,mmol/L(NH4)2SO4終止反應(yīng)，于激發(fā)波長(zhǎng)350,nm下檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)500,nm下的熒光強(qiáng)度．

酶活力定義：每分鐘催化1 nmol/L的MDC插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定義為1個(gè)活力單位(U)．

1.2.6 重組菌C．glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

重組菌生長(zhǎng)曲線的繪制：將培養(yǎng)過夜的菌液按1%,的接種量接入50,mL含有10,μg/mL氯霉素的MMTG培養(yǎng)中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔一定時(shí)間取樣，以MMTG培養(yǎng)基為空白對(duì)照，檢測(cè)培養(yǎng)液600,nm下的吸光度．以該菌種培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線．

最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定：分別在接種4、8、12、16、20,h后加入終濃度為1,mmol/L的IPTG開始誘導(dǎo)，30,℃誘導(dǎo)48,h，檢測(cè)分析誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)proD-BTG表達(dá)量的影響．

最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG開始誘導(dǎo)，30,℃誘導(dǎo)20、30、40、50、60 h，檢測(cè)分析誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)proD-BTG表達(dá)量的變化．

IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定：在最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)加入終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L的IPTG開始誘導(dǎo)，30,℃誘導(dǎo)至最佳時(shí)間，分析IPTG濃度對(duì)proD-BTG表達(dá)的影響．

2 結(jié)果與分析

2.1 Sprodbtg基因的擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的質(zhì)粒pET28a-prodbtg中目的基因未發(fā)生突變，以該質(zhì)粒作為模板，分別用引物P1、R1和P2、R1擴(kuò)增基因Sprodbtg．PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得約為1,100,bp的目的片段(圖1)，其大小與Sprodbtg預(yù)計(jì)大小相符，表明Sprodbtg擴(kuò)增成功．該基因上游外源加入了一段SD序列及C．glutamicum高效分泌蛋白的信號(hào)肽序列ΔS0949，使得prodbtg具有了在C．glutamicum中分泌表達(dá)的潛力．

2.2 重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物切膠回收后用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，后與同樣經(jīng)過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切的質(zhì)粒 pXMJ19連接，然后轉(zhuǎn)化至E．coli JM109，涂布含氯霉素質(zhì)量濃度為50,μg/mL的平板．經(jīng)篩選挑取陽性菌落活化后提取質(zhì)粒，用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，同時(shí)將pXMJ19 空質(zhì)粒用 HindⅢ進(jìn)行單酶切作為對(duì)照，結(jié)果如圖2所示．空質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ單酶切獲得約6,600,bp的片段，重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切獲得約6,600,bp和1,100,bp的兩條帶，其中大片段與空質(zhì)粒pXMJ19大小(6,600,bp)相符，小片段與目的基因Sprodbtg大小相符，表明Sprodbtg基因已成功連接到表達(dá)載體上．

圖1 Sprodbtg PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Identification of Sprodbtg

圖2 質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg酶切驗(yàn)證Fig. 2 Recombined plasmids pXMJ19-Sprodbtg digested by restricted endonuclease

2.3 谷氨酸棒桿菌的電轉(zhuǎn)化及鑒定

提取重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg并電擊轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細(xì)胞，以空質(zhì)粒pXMJ19作為對(duì)照菌株．涂布于含氯霉素10,μg/mL的LA抗性平板，挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗(yàn)證．

2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

按照1.2.4方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)48,h后的重組菌株C．glutamicum ATCC13032/ pXMJ19-Sprodbtg和對(duì)照菌株C．glutamicum ATCC13032/pXMJ19 發(fā)酵液經(jīng)TCA沉淀濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示．

圖3重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵上清液 SDS-PAGE 分析Fig. 3SDS-PAGE analysis of supernatant of C. glutamicum of the recombined strains

泳道1陽性轉(zhuǎn)化子C. glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg在大約3.8×104處出現(xiàn)1條特異性蛋白條帶，其大小與預(yù)測(cè)的proD-BTG的相對(duì)分子質(zhì)量一致．泳道2中對(duì)照菌C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19未見相應(yīng)目的蛋白條帶，從而初步說明proD-BTG在谷氨酸棒桿菌中被成功分泌表達(dá)．

2.5 酶原蛋白proD-BTG的酶活力測(cè)定

重組菌C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg表達(dá)酶原蛋白 proD-BTG 經(jīng)Factor Xa切割后，熒光法測(cè)定酶活力，結(jié)果顯示BTG活力為(41.23±2.01)U/L．

2.6 重組菌C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.6.1 生長(zhǎng)曲線的繪制

重組菌在氯霉素濃度為10 μg/mL的MMTG培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線如圖4所示．由圖4可知：重組菌株4,h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14,h后生長(zhǎng)減緩，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期．

2.6.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白proD-BTG表達(dá)的影響

取不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的發(fā)酵液添加Factor Xa并測(cè)定重組菌BTG的活力，結(jié)果如圖5所示．在培養(yǎng)4 h后進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白在重組菌中表達(dá)量非常低；然后隨著菌體密度的增大而進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白的表達(dá)量也隨之增加．在培養(yǎng)12 h(A600約為2.2)時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)達(dá)到最高酶活力(47.43±2.34)U/L，此時(shí)為重組菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中后期，目的蛋白的表達(dá)量基本達(dá)到最大，之后表達(dá)量開始下降，這可能是后期培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)被大量消耗，缺乏充足的營(yíng)養(yǎng)用于目的蛋白的合成，因此當(dāng)培養(yǎng)12,h后開始誘導(dǎo)，為最適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī).

圖4 C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg生長(zhǎng)曲線Fig. 4 Growth curve of C. glutamicum ATCC13032/ pXMJ19-Sprodbtg

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)proD-BTG蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of different inducing period on protein proD-BTG expression

2.6.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白proD-BTG表達(dá)的影響

如圖6所示，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為10～40 h時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，最高達(dá)到(54.69±3.35)U/L；而當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過40 h后，表達(dá)量有所下降，推測(cè)可能由于菌體開始進(jìn)入衰亡期，裂解的菌體釋放出的蛋白酶降解了部分重組蛋白，導(dǎo)致重組蛋白表達(dá)量的下降．所以最佳誘導(dǎo)時(shí)間定為40 h．

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)proD-BTG蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of induction time on protein proD-BTG expression

2.6.4 IPTG濃度對(duì)目標(biāo)蛋白proD-BTG表達(dá)的影響

IPTG對(duì)細(xì)胞有一定的毒性[16]，所以加入合適濃度的IPTG，才能使目的蛋白得到高效表達(dá)．IPTG濃度在0.01～5.0,mmol/L的范圍內(nèi)可能對(duì)表達(dá)產(chǎn)生影響[17]．IPTG濃度對(duì)目標(biāo)蛋白proD-BTG表達(dá)的影響如圖7所示．

圖7 不同IPTG濃度對(duì)proD-BTG蛋白表達(dá)的影響Fig. 7Effect of different concentration of IPTG on protein proD-BTG expression

當(dāng)IPTG濃度為0.4～0.8 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量隨著IPTG濃度的增加而增加，最高達(dá)到(55.62±2.34)U/L；當(dāng)IPTG濃度增大到1.0 mmol/L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量也能達(dá)到最高，但考慮到成本的節(jié)約，將0.8 mmol/L作為IPTG的最優(yōu)誘導(dǎo)濃度.

3 結(jié) 語

本文在前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)谷氨酸棒桿菌重組菌株C. glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化．重組菌培養(yǎng)12 h后A600約為2.2時(shí)，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)40 h．優(yōu)化后的發(fā)酵上清液酶活力由(41.23±2.01)U/L提高到(55.62±2.34)U/L，比優(yōu)化前提高了約34.90%,，為BTG進(jìn)一步的高效制備奠定了基礎(chǔ)．

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責(zé)任編輯：郎婧

Expression of the Transglutaminase from Bacillus subtilis and Optimization of Fermentation Conditions for Corynebacterium glutamicum

HUANG Lin，LIU Yihan，LI Mingjie，LI Rui，GUO Wei，GUI Shuang，LU Fuping
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Overlap PCR was used to produce Sprodbtg encode with transglutaminase(BTG)from Bacillus subtilis．The recombined gene Sprodbtg contains signal peptide ΔS0949 from Corynebacterium glutamicum，SD sequence and the proDBTG gene．The sprodbtg was cloned into pXMJ19 to construct secretion expression vector pXMJ19-Sprodbtg．After that，the recombined plasmid was transformed into C．glutamicum ATCC13032 to express proD-BTG．The optimized fermentation conditions were also studied．The results showed that the recombined strain C．glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg accumulated proD-BTG up to a level of (41.23±2.01)U/L．The optimized conditions for the induction of expression of the recombined protein proD-BTG in strain 13032/pXMJ19-Sprodbtg were as follows：growing in MMTG medium for 12 h，adding IPTG with a final concentration of 0.8 mmol/L and the subsequent incubation for 40 h．The activity of BTG reached (55.62±2.34)U/L，a 34.90%, increase compared with the non-optimized control.

transglutaminase；Corynebacterium glutamicum；Bacillus subtilis；secretion expression；condition optimization

Q814.4

A

1672-6510(2016)06-0011-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20160044

2016-02-18；

2016-05-16

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目(14JCYBJC23800)；天津市科技特派員資助項(xiàng)目(15JCTPJC56500)

黃 琳（1984—），女，天津人，實(shí)驗(yàn)師；

路福平，教授，lfp@tust.edu.cn.

數(shù)字出版日期：2016?07?11；數(shù)字出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20160711.1615.010.html.