劉詩雨,米婷婷,任建東,范開華,何 菱*

·研究論文·

計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)新型人脂肪酸合酶抑制劑及其抗腫瘤活性

劉詩雨1,米婷婷2*,任建東2,范開華2,何 菱1*

(1.四川大學(xué) 華西藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.中國人民解放軍 成都軍區(qū)總醫(yī)院 藥劑科，四川 成都 610083)

以O(shè)rlistat為先導(dǎo)化合物，利用AutoDock進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接，在對(duì)接結(jié)果中選擇能量較低的6個(gè)結(jié)構(gòu)進(jìn)行合成與抗腫瘤活性篩選。以orlistat為原料，經(jīng)2步反應(yīng)制得芐基(2S,3S,5S)-2-己基-3,5-二羥基十六酸酯(2)；再經(jīng)4步反應(yīng)獲得(3S,4S)-3-己基-4-[(S)-2-羥基十三烷基]氧雜環(huán)丁烷-2-酮(5);5在EDCI作用下與酸經(jīng)縮合反應(yīng)合成了4個(gè)計(jì)新型人脂肪酸合酶抑制劑(6a～6d)，其中6b～6d為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR 和HR-MS(ESI)表征。體外初步活性測(cè)試表明：(S)-1-[(1S,2S)-3-己基-4-氧代氧雜環(huán)丁烷-2-基]十三烷-2-煙酸酯(6a)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有較好的抑制作用，其IC50為11.72 μmol·mL-1，優(yōu)于Orlistat(21.5 μmol·mL-1)。

Orlistat;計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì);抗腫瘤活性;合成；人脂肪酸合酶抑制劑

隨著人類平均壽命的延長，以及環(huán)境的持續(xù)惡化，惡性腫瘤已經(jīng)成為人類生命與健康安全的一大威脅。傳統(tǒng)的化療藥物雖然能對(duì)腫瘤細(xì)胞起到一定的抑制作用，但因其作用機(jī)制等原因，不良反應(yīng)也較為嚴(yán)重；且腫瘤細(xì)胞易突變，很容易產(chǎn)生耐藥性。因此，尋找新靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物成為了抗腫瘤藥物的一個(gè)設(shè)計(jì)思路。

Scheme 1

Orlistat對(duì)人脂肪酸合酶具有抑制作用[1],且Orlistat與人脂肪酸合酶結(jié)合的單晶及其結(jié)合方式已確定[2]。而人脂肪酸合酶在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)均有較高表達(dá)[3-5]，抑制此酶可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5-7]。根據(jù)Orlistat與人脂肪酸合酶的結(jié)合單晶可知，四元內(nèi)酯環(huán)是形成Orlistat酰脂肪酸合酶的必須結(jié)構(gòu)，兩條長脂肪鏈則提供結(jié)合初期絕大部分的疏水力。因此，我們希望以O(shè)rlistat為先導(dǎo)化合物，保留其長脂肪鏈與四元內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，借助計(jì)算機(jī)輔助，設(shè)計(jì)一系列Orlistat衍生物，以期得到抗腫瘤活性較強(qiáng)的化合物。

本研究以O(shè)rlistat為原料[4]，經(jīng)水解，芐溴保護(hù)羧基生成芐基(2S,3S,5S)-2-己基-3,5-二羥基十六酸酯(2)；2經(jīng)選擇性保護(hù)5-位羥基生成芐基(2S,3S,5S)-2-己基-3-羥基-5-[(三異丙基硅基)氧基]十六酸酯(3)；3經(jīng)鈀碳催化氫解與N-苯基-雙三氟甲磺酰亞胺合環(huán)生成(3S,4S)-3-己基-4-{(S)-2-[(三異丙基硅基)氧基]十三烷基}氧雜環(huán)丁烷-2-酮(4)；4在氟化氫吡啶鹽的作用下脫去硅保護(hù)生成(3S,4S)-3-己基-4-[(S)-2-羥基十三烷基]氧雜環(huán)丁烷-2-酮(5)；最后5與不同羧酸在EDCI作用下縮合形成新型人脂肪酸合酶抑制劑(6a～6d，Scheme 1)，其中6b～6d 為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR 和HR-MS(ESI)表征。并對(duì)化合物2,5及6a～6d的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步探索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian Mercury 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Aglient-6890型質(zhì)譜儀;分子模擬工作站(聯(lián)想深騰1800型服務(wù)器，Autodock 4.0，Chimera，Accelrys DS Visualizer 模擬軟件) 。

Orlistat，純度98%，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 分子模擬和化合物虛擬篩選

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載2PX6.pdb文件作為生物大分子[2]。利用Chimera剝離單晶中的配體，水分子等小分子，使結(jié)合空腔暴露出來。采用AutoDock-Tools 1.5.6分別導(dǎo)入配體與大分子文件，并為其添加極性氫與電荷。根據(jù)已有單晶中orlistat與人脂肪酸合酶的硫酯酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位置確定模擬計(jì)算時(shí)格子中心坐標(biāo)為(13.51，-5.582，27.876)，格子大小為(48 ?×42 ?×54 ?)，格點(diǎn)間距0.375 ?。分子對(duì)接運(yùn)算采用 Lamarckian 遺傳算法(對(duì)接循環(huán)參數(shù) 200，其余參數(shù)為默認(rèn)值)，配體和受體間的結(jié)合情況采用半經(jīng)驗(yàn)自由能計(jì)算方法。具體運(yùn)算用 Autodock 4.2.6完成。采用分子對(duì)接算法模擬化合物與人脂肪酸合酶的結(jié)合模式與能量。在模擬計(jì)算的配體數(shù)據(jù)庫中選取結(jié)合能量較低的化合物進(jìn)行合成，并進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選。

1.3 合成

(1) 2的合成[6]

(2) 3的合成[6]

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在反應(yīng)瓶中加入2 1.35 g(2.82 mmol)和無水DCM 31 mL，冷卻至-78 ℃，攪拌下加入2,4,6-三甲基吡啶0.95 mL和TIPSOTf 1.2 mL，加畢，于-78 ℃反應(yīng)3 h。加水淬滅反應(yīng)，用DCM萃取4次，合并有機(jī)相，依次用1 mol·mL-1鹽酸和飽和氯化鈉溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，過濾，濾液濃縮得無色油狀粗產(chǎn)物，經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=20/1)純化得無色油狀液體3 1.73 g，產(chǎn)率95.6%；1H NMRδ:7.36～7.31(m,5H),5.08(s,2H),4.85(d,J=4.0 Hz,1H),4.03～4.02(m,1H),3.64～3.61(m,1H),2.39～2.37(m,1H),1.55～1.13(m,35H),1.05～0.91(m,18H),0.86～0.81(m,6H)。

(3) 4的合成[6]

向100 mL燒瓶中加入3 1.73 g(2.79 mmol)，10%無水鈀碳300 mg與無水乙酸乙酯15 mL，攪拌下于常溫常壓進(jìn)行氫解。抽濾，濾液濃縮得無色油狀物中間體，加入無水DCM 25 mL和TEA 0.77 mL，攪拌下加入PhNTf21.5 g，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫反應(yīng)過夜。濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(石油醚)：V(二氯甲烷)=6：1]純化得無色油狀液體4 0.90 g，產(chǎn)率63.2%；1H NMRδ:4.50～4.47(m,1H),3.99～3.97(m,1H),3.28～3.24(m,1H),2.10～1.26(m,35H),1.06(m,18H),0.89～0.87(m,6H)。

(4) 5的合成[6]

在塑料反應(yīng)器中加入4 750 mg(1.47 mmol)，無水THF 12.5 mL，攪拌下于5～10 ℃加入HF-Py (65～70%) 1.02 g，緩慢升至室溫，反應(yīng)過夜。加水淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用無水Na2SO4干燥。抽濾，濾液濃縮，殘余物經(jīng)經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=7/1)純化得白色石蠟狀固體5 380 mg，產(chǎn)率73.1%；1H NMRδ:4.49～4.45(m,1H),3.82～3.77(m,1H),3.34～3.29(m,1H),2.06～1.23(m,33H),0.89～0.87(m,6H)。

(5) 6a～6d的合成(以6a為例[5])

隨著國網(wǎng)供電公司對(duì)于智能化電網(wǎng)工作的不斷推進(jìn)以及新型電力營銷方法的普及，對(duì)電網(wǎng)智能化和精細(xì)化管理要求越來越高。為滿足國網(wǎng)供電公司營配業(yè)務(wù)的高效運(yùn)行，滿足配電網(wǎng)維修、搶修效率的要求，實(shí)現(xiàn)以“標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范先行、數(shù)據(jù)治理和應(yīng)用融合并重、應(yīng)用建設(shè)促功能實(shí)用化”的工作思路，重點(diǎn)推進(jìn)營配業(yè)務(wù)數(shù)據(jù)的整理、錄入、核實(shí)以及信息化采集系統(tǒng)適用性改造等工作，清理原始數(shù)據(jù)，規(guī)范新增數(shù)據(jù)；同時(shí)也為提高居民低壓集抄系統(tǒng)建設(shè)小區(qū)的臺(tái)區(qū)線損率計(jì)算準(zhǔn)確性，研發(fā)和推廣適應(yīng)新形勢(shì)下電網(wǎng)建設(shè)和電網(wǎng)精細(xì)化管理的新一代全數(shù)字化、多功能、智能化臺(tái)區(qū)識(shí)別儀，可以滿足電網(wǎng)建設(shè)和管理需要，為實(shí)現(xiàn)臺(tái)區(qū)精細(xì)化管理提供真實(shí)準(zhǔn)確的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[2]。

在反應(yīng)瓶中加入5 30 mg(0.084 6 mmol)，EDCI 33 mg，DMAP 21 mg，煙酸21 mg和無水DCM 3 mL，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。經(jīng)經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑 ：A=9/1)純化得6a。

用類似的方法合成6b～6d。

6a：無色油狀液體，收率84.8%;1H NMRδ:9.29(br s,1H),8.87(br s,1H),8.65(d,J=7.6 Hz,1H),7.74(br s,1H),5.38～5.36(m,1H),4.41～4.37(m,1H),3.28～3.24(m,1H),2.34～1.26(m,32H),0.89～0.87(m,6H)。

6b：無色油狀液體，收率86.5%；1H NMRδ:6.44(dd,J=1.2 Hz,17.4 Hz,1H),6.15(dd,J=10.4 Hz,17.4 Hz,1H),5.88(dd,J=1.2 Hz,17.4 Hz,1H),5.09～5.03(m,1H),4.36～4.31(m,1H),3.25～3.19(m,1H),2.26～1.25(m,32H),0.89～0.86(m,6H)；13C NMRδ:171.05,165.69,131.12,128.39,74.68,71.27,56.97,38.68,34.15,31.93,31.47,29.63,29.54,29.46,29.35,28.97,27.69,26.69,25.26,22.70,22.51,14.11,14.01；HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C25H44O4{[M+H]+}409.324 0,found 409.331 2。

6c：無色油狀液體，收率73.0%；1H NMRδ:7.71(d,J=16.0 Hz,1H),7.55～7.53(m,2H),7.41～7.39(m,3H),6.45(d,J=16.0 Hz,1H),5.13～5.11(m,1H),4.41～4.36(m,1H),3.27～3.22(m,1H),2.30～1.25(m,32H),0.89～0.83(m,6H)；13C NMRδ:171.12,166.41,145.27,134.17,130.42,128.87,128.08,117.72,74.68,71.06,56.85,38.64,34.18,31.85,31.42,29.57,29.49,29.41,29.31,28.94,27.64,26.66,25.25,22.63,22.45,14.08,13.96；HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C31H49O4{[M+H]+} 485.363 1,found 485.364 2。

6d：無色油狀液體，收率76.1%；1H NMRδ:8.071(brs,1H),7.63(d,J=8.0 Hz,1H),7.37(d,J=8.0 Hz,1H),7.22～7.18(m,2H),7.15～7.11(m,1H),4.99～4.97(m,1H),4.15～4.10(m,1H),3.77(s,2H),3.10～3.06(m,1H),2.14～1.20(m,32H),0.89～0.86(m,6H);13C NMRδ:171.63,171.26,136.07,127.03,123.04,122.20,119.64,118.72,111.21,108.21,74.71,71.32,56.61,38.48,34.05,31.86,31.61,31.39,29.57,29.47,29.39,29.30,29.25,28.85,27.42,26.50,25.16,22.64,22.48,14.08,13.99；HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C32H50NO4{[M+H]+} 512.374 0,found 512.373 3。

1.4 抗腫瘤活性測(cè)定

乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231在含有10%胎牛血清，42 mmol·L-1谷氨酰胺，1 mmol·L-1丙酮酸鈉，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素和0.25 μg·mL-1兩性霉素的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)物于37 ℃的溫度下維持在5%CO2。細(xì)胞被接種在含有10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基的24孔板培養(yǎng)板上，接種密度為每孔20 000個(gè)。然后將細(xì)胞用Orlistat衍生物在0.01 mmol·L-1至1 nmol·L-1間的5種不同的劑量范圍培養(yǎng)5 d。等體積的DMSO被用作空白對(duì)照。利用細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞活力分析儀(Beckman Coulter公司)進(jìn)行計(jì)數(shù)。以藥物處理過的細(xì)胞存活數(shù)除以空白對(duì)照的細(xì)胞存活數(shù)計(jì)算細(xì)胞存活百分比。從試驗(yàn)化合物的劑量-存活比曲線計(jì)算的IC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接

分子模擬與實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差的原因主要有：(一)由于AutoDock的模擬計(jì)算是以配體已經(jīng)進(jìn)入大分子的特定區(qū)域?yàn)榍疤徇M(jìn)行對(duì)接，因此對(duì)由于分子大小或理化性質(zhì)等原因造成配體難以進(jìn)入該區(qū)域與大分子結(jié)合的化合物將產(chǎn)生較大偏差；(二)本次計(jì)算使用的是剛性大分子，無法對(duì)配體-受體間的誘導(dǎo)契合效應(yīng)進(jìn)行模擬與評(píng)價(jià)；(三)AutoDock本身計(jì)算精度有限，且模擬對(duì)接時(shí)使用的是去除水分子的大分子模型，因此模擬對(duì)接會(huì)與真實(shí)的配體-受體的接合過程存在差異；(四)AutoDock的模擬對(duì)接是以可逆吸附為前提計(jì)算的，因此對(duì)共價(jià)藥物會(huì)出現(xiàn)一定的偏差。

圖1 6a與6d的對(duì)接結(jié)果

如圖1所示，6a的吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)可以與TYR2343的苯環(huán)形成π—π堆積，其四元內(nèi)酯環(huán)的羰基氧可以與SER2308和HIS2481兩個(gè)氨基酸殘基形成氫鍵并將四元內(nèi)酯環(huán)固定在SER2308附近，使其與orlistat酰脂肪酸合酶的結(jié)構(gòu)更加接近，更容易形成共價(jià)鍵[2]。

與6a的作用類似，6d結(jié)構(gòu)中吲哚乙酸的羰基氧與TYR2343形成氫鍵，且四元內(nèi)酯環(huán)的羰基氧與HIS2481形成氫鍵。增加了6d與脂肪酸合酶的結(jié)合力。以上因素可能是6a與6d活性較高的原因。

2.2 抗腫瘤活性

為了驗(yàn)證模擬對(duì)接結(jié)果，我們以MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞為模型，測(cè)試各化合物對(duì)該腫瘤細(xì)胞的IC50值，結(jié)果見表1。由表1可見，6a和6d對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的抑制活性明顯優(yōu)于Orlistat。尤其是6a(IC50=11.72 μmol·mL-1)?？煽闯霎?dāng)R含氮芳香雜環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)其抗腫瘤作用較好，為以后相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

表1 化合物的抗腫瘤活性

*μmol·mL-1。

3 結(jié)論

通過計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，以O(shè)rlistat為原料經(jīng)水解保護(hù)、關(guān)環(huán)、脫保護(hù)及酯化等步驟反應(yīng)合成了6個(gè)新型人脂肪酸合酶抑制劑(2、5、6a～6d) ，其中6b～6d為新化合物。體外活性測(cè)試表明：(S)-1-[(1S,2S)-3-己基-4-氧代氧雜環(huán)丁烷-2-基]十三烷-2-煙酸酯(6a)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞有較好的抑制活性，其IC50為11.72 μmol·mL-1，優(yōu)于Orlistat (21.5 μmol·mL-1)。說明基于人脂肪酸合酶的計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果與該化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性是相關(guān)的。

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Computer Aided Design of Novel Human Fatty Acid Synthase Inhibitors and Their Antitumor Activities

LIU Shi-yu1, MI Ting-ting2*, REN Jian-dong2, FAN Kai-hua2, HE Ling1*

(1.West China School of Pharmacy,Sichuan University，Chengdu 610041,China； 2.Pharmaceutical Preparation Section of Chengdu Military General Hospital，Chengdu 610083,China)

With orlistat as the pilot，six compounds with low-energy structures were chosen by computer stimulation for further synthesis and a ntineoplastic activity screening using AutoDock.Benzyl (2S,3S,5S)-2-hexyl-3,5-dihydroxyhexadecanoate(2) was prepared by two steps of reaction from Orlistat.(3S,4S)-3-hexyl-4-[(S)-2-hydroxytridecyl]oxetan-2-one(5) was prepared by four steps of reaction from 2.Human fatty acid synthase inhibitors(6a～6d) were obtained from 5 by condensation reaction with corresponding acid in the presence of EDCI,Among them 6b～6d were novel compounds.The structures were characterized by1H NMR,13C NMR and HR-MS(ESI).Invitrotest results showed that(S)-1-[(2S,3S)-3-hexyl-4-oxooxetan-2-yl]tridecan-2-yl nicotinate(6a) exhibited better inhibitory activity againstfattyacidsynthasewith IC50of 11.72 μmol·mL-1,which is better than Orlistat (21.5 μmol·mL-1).

Orlistat;computer-aided drug design;antineoplastic；synthesis;human fatty acid synthase Inhibitor

2016-03-28；

2016-09-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21072131)；四川省科技廳科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015SZ0168)

劉詩雨(1989-)，男，漢族，河北唐山人，碩士，主要從事藥物化學(xué)的研究。 E-mail:470558926@qq.com

何菱，教授，Tel.028-85503365,E-mail:lhe2001@sina.com.cn；米婷婷，主管藥師，E-mail:miting85@163.com

O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.12.16086