戴俊杰 曾慶意 丁美萍

重癥肌無力患者血清Titin抗體和RyR抗體的臨床研究

戴俊杰 曾慶意 丁美萍

目的 探討重癥肌無力（MG）患者血清Titin抗體和Ryanodine受體（RyR）抗體的臨床意義。方法 采用ELISA法檢測61例MG患者和35例健康體驗者（正常對照組）的血清Titin抗體、RyR抗體、AChR抗體。結(jié)果 MG組Titin抗體和RyR抗體陽性率均顯著高于對照組（均P＜0.001）；合并胸腺瘤MG（MGT）組患者Titin抗體陽性率明顯高于未合并胸腺瘤MG（NTMG）組（P＜0.01）；MGT組和NTMG組患者RyR抗體陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；晚發(fā)型MG患者中Titin抗體和RyR抗體陽性率均明顯高于早發(fā)型MG患者（均P＜0.05）；全身型或重癥型（ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ型）Titin抗體陽性率顯著高于眼肌型（Ⅰ型）（P＜0.01），而兩組間RyR抗體陽性率未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；MG患者Titin抗體和RyR抗體水平與肌無力嚴重程度相關分析呈正相關（r=0.520、0.487，均P＜0.01）。結(jié)論 Titin抗體和RyR抗體檢測有助于MG的診斷，且Titin抗體有助于鑒別MG患者是否伴隨胸腺瘤及進行Osserman分型。Titin抗體與RyR抗體水平還與MG患者病情的嚴重程度相關，可應用于評估MG患者的病情與預后。

重癥肌無力 Titin抗體 RyR抗體 胸腺瘤

【 Abstract】 Objective To investigate serum Titin antibody and Ryanodine receptor(RyR)antibody levels in patients with myasthenia gravis(MG)and their clinical significance. Methods Serum Titin antibody and RyR antibody were detected with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)in 61 MG patients(MG group)and 35 healthy subjects (control group). Results The positive rates of Titin antibody and RyR antibody were 62.3%and 49.2%in MG group,those in control group were 11.4%and 8.6%(both P＜0.001).The positive rates of Titin antibody in MG patients with thymoma(MGT）was significantly higher than that in those without thymoma(NTMG)(P＜0.01).There was no significant difference in RyR antibody positive rate between MGT group and NTMG group(P＞0.05).The positive rates of Titin antibody(80.0%)and RyR antibody (63.3%)were higher in late-onset MG patients than those in early-onset MG patients(both P＜0.05).The positive rate of serum Titin antibody in generalized or severe MG patients(ⅡA,ⅡB,Ⅲ,Ⅳtype)was significantly higher than that in ocular MG (I type)patients(P＜0.01),while no significant difference was observed in positive rate of RyR antibody(P＞0.05).In MG patients,the level of Titin antibody and RyR antibody was positively correlated with the severity of muscle weakness (r=0.520 and 0.487,both P＜0.001). Conclusion Serum Titin antibody and/or RyR antibody levels may be of value in diagnosis of MG and the severity of the disease.In addition,Titin antibody may distinguish MGT from NTMG and Osserman calssification.

重癥肌無力（MG）是由乙酰膽堿受體（AChR）抗體介導、細胞免疫依賴、補體參與的主要累及神經(jīng)-肌肉接頭傳遞障礙的一種獲得性自身免疫性疾病。AChR抗體陽性有助于診斷MG，但臨床上有20%～40%MG患者血清AChR抗體為陰性[1]。因此目前認為MG發(fā)病機制中，除AChR抗體外，還有多種自身抗體存在，如連接素（Titin）抗體、Ryanodine受體（RyR）抗體、肌肉特異性酪氨酸激酶（MuSK）抗體等[2]。筆者采用ELISA法檢測MG患者及正常健康者血清中Titin抗體及RyR抗體，探討Titin抗體和RyR抗體在MG診斷、年齡分類、合并胸腺瘤與否、Osserman分型、肌無力嚴重程度評估中的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集寧波市李惠利醫(yī)院2011年10月至2013年5月診治的61例MG患者，依據(jù)典型臨床表現(xiàn)、新斯的明試驗、重復神經(jīng)電刺激、血清AChR抗體測定、胸腺CT等檢查確診。其中男24例，女37例；年齡14～81歲,平均49.1歲；早發(fā)型（發(fā)病年齡≤50歲）31例，晚發(fā)型（發(fā)病年齡＞50歲）30例；接受手術治療30例，其中病理檢查證實胸腺瘤者24例，胸腺增生者6例，其余31例MG患者均經(jīng)胸部CT證實（除外胸腺病變）。Osserman分型Ⅰ型19例，ⅡA型12例，ⅡB型22例，Ⅲ型5例，Ⅳ型3例，并按改良Oosterhuis 5分評定法評定肌無力嚴重程度，其中1分者19例，2分者12例，3分者22例，4分者8例，5分者0例。選擇同期寧波市李惠利醫(yī)院健康體檢者35例作為正常對照組，均為排除神經(jīng)系統(tǒng)及自身免疫系統(tǒng)疾病，其中男14例，女21例；年齡19～74歲，平均47.2歲。兩組患者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法 兩組患者均于清晨空腹抽取靜脈全血4ml，分離血清，凍存于-20℃冰箱待檢。采用美國RB試劑公司生產(chǎn)的人Titin抗體試劑盒和人RyR抗體試劑盒以及源葉生物科技有限公司生產(chǎn)的人AChR抗體試劑盒，嚴格按照說明書采用ELISA進行檢測。設置標準品孔和樣品孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μl。樣品孔先加待測樣本10μl，再加樣本稀釋液40μl；空白孔不加。除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔注入洗液350μl，浸泡1min，用洗板機洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl，37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl，15min內(nèi)在450nm波長處測定各孔的OD值。繪制標準曲線，在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣品濃度值。Titin抗體和RyR抗體陽性結(jié)果判斷：以大于正常對照組所測濃度值的均值加上2倍的標準差為抗體陽性判斷閾值。＞23.14pmol/ml判斷為Titin抗體陽性，＞42.15U/L判斷為RyR抗體陽性，AChR抗體陽性結(jié)果判斷：以＞S 2.5標準品濃度（120pmol/L）判斷為AChR抗體陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，各組抗體陽性率比較采用χ2檢驗，抗體水平與肌無力嚴重程度的關系采用Spearman秩相關分析，一致性比較采用配對χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同組別Titin抗體和RyR抗體陽性率的比較 MG組 Titin抗體陽性率為 62.3%，RyR抗體陽性率為49.2%；正常對照組中Titin抗體陽性率為11.4%，RyR抗體陽性率為8.6%，MG組兩種抗體的陽性率均高于對照組（均P＜0.001）。晚發(fā)型MG患者中Titin、RyR抗體陽性率高于早發(fā)型（均P＜0.01）。合并胸腺瘤MG（MGT）患者Titin抗體陽性率高于未合并胸腺瘤MG（NTMG）患者（P＜0.01）；MGT與NTMG組患者RyR抗體陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。全身型或重癥型（ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ型）MG患者Titin抗體的陽性率高于眼肌型（Ⅰ型）MG患者（P＜0.01）。眼肌型患者RyR抗體陽性率相較于全身型或重癥型比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表1。

2.2 Titin抗體及RyR抗體水平與肌無力嚴重程度評估 根據(jù)改良Oosterhuis5分法評定MG患者肌無力嚴重程度分為1、2、3、4分共4個組別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Titin抗體、RyR抗體水平與肌無力嚴重程度均呈正相關（r= 0.520、0.487，均P＜0.001），詳見表2。

2.3MG患者AChR抗體、Titin抗體及RyR抗體一致性比較 MG患者AChR抗體、Titin抗體及RyR抗體陽性結(jié)果一致性比較顯示AChR抗體與Titin抗體AChR抗體與RyR抗體均未見顯著一致性關系，而Titin抗體與RyR抗體之間存在一定的一致性，但其吻合度較差，詳見表3～5。

3 討論

MG是一種自身免疫性疾病，除已明確的AChR抗體外，部分MG患者血清中還有Titin抗體及RyR抗體[2]。Titin抗體主要針對連接素分子上位于A/I帶交界處主要免疫原性區(qū)cDNA序列所表達的MGT-30分子，影響肌小結(jié)的收縮，導致肌無力的發(fā)生[3]。RyR是一種跨膜型的鈣通道蛋白質(zhì)，其功能區(qū)域在鈣離子釋放及骨骼肌興奮收縮藕聯(lián)中起作用，RyR抗體影響了RyR鈣的釋放，使骨骼肌不能有效收縮，從而產(chǎn)生肌無力的癥狀[4]。本研究發(fā)現(xiàn)AchR抗體與Titin抗體及RyR抗體檢測結(jié)果未見顯著一致性，這也進一步提示Titin抗體和RyR抗體作為抗骨骼肌抗體與AchR抗體作用機制存在不同。

本實驗研究結(jié)果顯示，在MG組中陽性率高達62.3%，顯著高于正常對照組（11.4%），而RyR抗體在MG組陽性率也高達49.2%，同樣明顯高于對照組（8.6%）。國內(nèi)王巍煒等[5]通過對89例患者進行MG相關抗體研究發(fā)現(xiàn)Titin抗體和RyR抗體的陽件率分別為64.0%和55.0%。本組數(shù)據(jù)與國內(nèi)同類研究[5]相近。Titin抗體和RyR抗體在MG患者中的高表達，提示兩種抗體均可作為診斷MG的一種輔助指標。

表1 不同組別Titin抗體和RyR抗體陽性率的比較

表2 不同肌無力嚴重程度組別Titin抗體和RyR抗體濃度及相關性分析

表3 MG患者AChR抗體與Titin抗體一致性比較

表4 MG患者AChR抗體與RyR抗體一致性比較

表5 MG患者Titin抗體與RyR抗體一致性比較

有研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，Titin抗體和RyR抗體陽性率逐漸增高[6]。本研究中晚發(fā)型MG患者兩種抗體的陽性率（分別為80.0%和63.3%）明顯高于早發(fā)型MG患者（分別為45.2%和35.5%），提示Titin抗體和RyR抗體陽性多見于晚發(fā)型MG患者。國內(nèi)外Suzuki[7]、王巍煒等[5]研究也顯示了一致性。

本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MGT患者中，Titin抗體的陽性率為83.3%，NTMG患者中陽性率為48.6%，這提示Titin抗體對MGT診斷有較高的敏感性。國內(nèi)學者的研究也顯示了一致性，高楓等[8]報道Titin抗體可出現(xiàn)于80%的MGT患者血清。本研究顯示在MGT患者中，RyR抗體陽性率為58.3%，相較于NTMG患者（43.2%）無統(tǒng)計學差異。Takamori[9]報道約50%MGT患者體內(nèi)存在RyR抗體，本研究數(shù)據(jù)與其基本相當。而Suzuki等[3]及閻志慧等[10]研究發(fā)現(xiàn)在MGT患者中RyR抗體的陽性率為70%～80%，且與NTMG患者相比陽性率顯著增高（據(jù)其研究數(shù)據(jù)[10]分析所得），以上發(fā)現(xiàn)與本研究的結(jié)果出入原因可能為本研究并未對所有MG患者進行胸腺病理活檢，只通過CT對胸腺病變進行排除，而CT對胸腺病變診斷的假陰性率將近20%[11]，假設MGT患者RyR抗體的陽性率高于NTMG患者，本研究分類中NTMG患者中若摻雜MGT患者，則可能導致本研究結(jié)果MGT患者RyR抗體陽性率偏低，且未能顯著高于NTMG患者。已有實驗發(fā)現(xiàn)Titin抗體和RyR抗體均多見于MGT和晚發(fā)型MG患者[6]，且本研究一致性檢驗發(fā)現(xiàn)MG患者中這兩種抗體檢測結(jié)果存在一定的一致性，提示兩種抗體的產(chǎn)生可能有共同的機制。由此可推斷MGT患者兩種抗體陽性率可能均顯著高于NTMG患者，兩種抗體可協(xié)助鑒別是否合并胸腺瘤。

結(jié)合Osserman分型，本研究顯示與RyR抗體不同，全身型或重癥型（ⅡA、ⅡB、Ⅲ、Ⅳ型）MG患者Titin抗體的陽性率高于眼肌型（Ⅰ型）MG患者。這與朱殊等[12]研究結(jié)果相同，提示Titin抗體對MG患者分型有一定幫助。

本研究結(jié)果顯示MG患者血清Titin抗體和RyR抗體檢測值與肌無力嚴重程度評分正相關，病情程度越嚴重的患者，其Titin抗體和RyR抗體吸光度值越高，說明Titin抗體和RyR抗體水平均可作為評價MG嚴重程度的一個客觀指標。閻志慧等[13]報道10例行胸腺手術的MG患者術后復查Titin抗體，發(fā)現(xiàn)Titin抗體水平較術前顯著下降，肌無力癥狀亦明顯減輕。李延峰等[14]通過對74例患者進行MG相關抗體研究發(fā)現(xiàn)，RyR抗體陽性MG患者臨床癥狀較重，且RyR抗體滴度與MG患者病情嚴重程度相關。因此，Titin抗體和RyR抗體都可以作為MG患者病情嚴重程度以及預后評價的指標，但具體的肌無力評分對應的抗體滴度水平設定仍需要更大樣本的研究進行確定。

綜上所述，血清Titin抗體和RyR抗體對MG有重要的臨床應用價值，可作為診斷MG的一種輔助指標。Titin抗體有助于鑒別MG患者是否伴隨胸腺瘤及進行Osserman分型以區(qū)分全身型或重癥型與眼肌型MG患者。Titin抗體與RyR抗體水平還與MG患者病情的嚴重程度相關，可應用于評估MG患者的病情與預后。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

《浙江醫(yī)學》對圖表的要求

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本刊編輯部

Serum Titin antibody and Ryanodine receptor antibody in patients with myasthenia gravis

DAI Junjie，ZENG Qingyi,DING Meiping. Department of Neurology,Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China

Myasthenia gravis Titin antibody RyR antibody Thymoma

2015-12-24）

315040 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（戴俊杰，曾慶意）；浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（丁美萍）

戴俊杰，E-mail：daijunjielove@126.com