付全航

術(shù)前射頻熱療聯(lián)合FOLFOX輔助治療對(duì)結(jié)腸癌組織中MVD以及凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響

付全航

目的 研究術(shù)前射頻熱療聯(lián)合FOLFOX輔助治療對(duì)結(jié)腸癌組織中微血管密度（MVD）以及凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響。方法 將2013年1月至2014年6月的120例結(jié)腸癌患者納入研究，依據(jù)輔助治療不同分為兩組，觀察組患者術(shù)前接受射頻熱療聯(lián)合FOLFOX化療，對(duì)照組僅接受FOLFOX化療。采用免疫組化染色的方法檢測(cè)腫瘤組織中的MVD，Real-time PCR和Western blot檢測(cè)腫瘤組織中凋亡相關(guān)分子的表達(dá)情況。結(jié)果 觀察組患者腫瘤組織中MVD低于對(duì)照組（P＜0.05）；觀察組患者腫瘤組織中Caspase-3、p16、Bax的mRNA和蛋白含量均高于對(duì)照組（均P＜0.05）；觀察組患者腫瘤組織中突變型p53基因以及CDC25A、Bcl-2的mRNA和蛋白含量均低于對(duì)照組（均P＜0.05）。結(jié)論 術(shù)前射頻熱療聯(lián)合FOLFOX輔助治療有助于降低結(jié)腸癌組織中的MVD，同時(shí)上調(diào)促凋亡分子、抑制抗凋亡分子的表達(dá)。

結(jié)腸癌 射頻熱療 微血管密度 細(xì)胞凋亡 凋亡調(diào)控基因

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，當(dāng)疾病發(fā)展至進(jìn)展期后，需要在手術(shù)前進(jìn)行輔助化療。FOLFOX是臨床上常用的結(jié)腸癌化療方案，通過(guò)鉑類(lèi)藥物、亞葉酸鈣和5-氟尿嘧啶的聯(lián)合應(yīng)用來(lái)發(fā)揮殺滅腫瘤細(xì)胞、縮小腫瘤體積的作用，同時(shí)也能使手術(shù)治療時(shí)病灶清除更加徹底[1]。但是，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前單獨(dú)采用FOLFOX進(jìn)行化療雖然可以有效地縮小腫瘤體積，卻無(wú)法清除較小的病灶；術(shù)后微小病灶的殘留成為了遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病理基礎(chǔ)[2]?；谝陨锨闆r，學(xué)者們致力于探尋能夠有效清除微小病灶的治療方法。射頻熱療是通過(guò)局部加溫來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的治療方法，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的治療。本研究中，筆者探討了術(shù)前射頻熱療聯(lián)合FOLFOX輔助治療對(duì)結(jié)腸癌組織中微血管密度（MVD）以及凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響，現(xiàn)將結(jié)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 將2013年1月至2014年6月我院收治的120例結(jié)腸癌患者納入研究，均經(jīng)結(jié)腸鏡病理活檢確診，符合結(jié)腸癌TNMⅢ期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)前均進(jìn)行輔助治療，根據(jù)輔助治療方法不同分為兩組，每組各60例。觀察組患者術(shù)前接受射頻熱療聯(lián)合FOLFOX化療，其中男38例，女22例，年齡55～74（65.96±7.69）歲；Ⅲa期患者28例，Ⅲb期患者17例，Ⅲc期患者15例；管狀腺癌48例，黏液腺癌10例，印戒細(xì)胞癌2例。對(duì)照組僅接受FOLFOX化療，其中男34例，女26例，年齡56～76（66.10±7.86）歲；Ⅲa期患者27例，Ⅲb期患者17例，Ⅲc期患者16例；管狀腺癌50例，黏液腺癌9例，印戒細(xì)胞癌1例。兩組患者一般資料比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 兩組患者均進(jìn)行FOLFOX化療，共治療2個(gè)周期，方法如下：奧沙利鉑130mg/m2靜脈滴注，第1天；亞葉酸鈣200mg/m2靜脈滴注，第1～5天；5-氟尿嘧啶300mg/m2靜脈滴注，第1～5天。觀察組患者在此基礎(chǔ)上給予射頻熱療，方法如下：采用UHR-2000大功率射頻治療儀對(duì)腹部大血管周?chē)M(jìn)行加熱，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肛溫；當(dāng)肛溫達(dá)到39℃時(shí)開(kāi)始靜脈滴注化療藥物，并保證肛溫由39℃升高到41.8℃耗時(shí)1～2h；靜脈滴注完成后，維持肛溫在41.3～41.8℃，持續(xù)2h。

1.2.2 樣本采集方法 所有患者治療前均留取結(jié)腸鏡病理活檢標(biāo)本。手術(shù)中再次收集腫瘤組織樣本并分為兩份，一份立即投入液氮中冷凍，10min后取出并保存于-80℃冰箱，用于下一步檢測(cè)；另一份投入4%多聚甲醛固定液，固定后用于石蠟包埋。

1.2.3 MVD檢測(cè) 連續(xù)切片后進(jìn)行CD31免疫組化染色，染色后先在低倍鏡（40×）下選取癌組織間質(zhì)中微血管較為集中的部位，而后轉(zhuǎn)為高倍鏡（100×）觀察，由2位高年資病理科醫(yī)師分別對(duì)視野內(nèi)血管數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，每例標(biāo)本計(jì)數(shù)5個(gè)視野，最后計(jì)算平均值作為MVD。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)分子 mRNA表達(dá)情況 取腫瘤組織約60mg，采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后保存于-80℃；檢測(cè)mRNA含量時(shí)采用天根生化公司的熒光定量PCR試劑盒分別擴(kuò)增突變型p53、CDC25A、Bcl-2、Caspase-3、p16、Bax基因，以β-actin為內(nèi)參照，通過(guò)軟件讀取目的基因和看家基因的起跳循環(huán)數(shù)（Ct值），按照ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA含量。設(shè)置對(duì)照組腫瘤組織中目的基因的mRNA含量為100，計(jì)算觀察組腫瘤組織中目的基因的mRNA含量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)分子的蛋白表達(dá)情況 取腫瘤組織約60mg，加入蛋白裂解液500μl后充分勻漿，于4℃、12 000r/min離心20min，取上清液加入loading buffer，100℃變性后進(jìn)行下一步檢測(cè)。按照配方配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，點(diǎn)樣后加入樣本并進(jìn)行垂直電泳和電轉(zhuǎn)膜；取出硝酸纖維素膜置于5%脫脂牛奶中封閉2h，而后在4℃條件下孵育突變型p53、CDC25A、Bcl-2、Caspase-3、p16、Bax、β-actin第一抗體；第2天取出NC膜并孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體2h，TBST液體洗滌3遍后進(jìn)行顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，按照目的基因灰度值與βactin灰度值的比值作為蛋白含量，設(shè)置對(duì)照組腫瘤組織中目的基因的蛋白含量為100，計(jì)算觀察組腫瘤組織中目的基因的蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 治療前后兩組患者腫瘤組織MVD比較 治療前觀察組患者腫瘤組織MVD為（45.29±5.03）/HP、對(duì)照組為（44.17±4.34）/HP，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。治療后觀察組患者腫瘤組織MVD為（26.69± 3.95）/HP，與治療前相比明顯下降（t=22.527，P＜0.05），也明顯低于對(duì)照組（t=6.797，P＜0.05）；治療后對(duì)照組患者腫瘤組織MVD為（42.45±6.14）/HP，與治療前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 治療前后兩組患者腫瘤組織中抗凋亡基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 治療后觀察組患者腫瘤組織中突變型p53基因以及CDC25A、Bcl-2基因的mRNA及相關(guān)蛋白的含量均低于治療前，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。治療后對(duì)照組患者腫瘤組織中以上基因的mRNA含量及相關(guān)蛋白含量與治療前相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。治療前觀察組患者腫瘤組織中以上基因的mRNA含量及相關(guān)蛋白含量與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；治療后觀察組則均低于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 治療前后兩組患者腫瘤組織促凋亡基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況 治療后觀察組患者腫瘤組織中Caspase-3、p16、Bax基因的mRNA含量及相關(guān)蛋白含量均高于治療前（均P＜0.05）。治療后對(duì)照組患者腫瘤組織中以上基因的mRNA含量及相關(guān)蛋白含量與治療前相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

表1 治療前后兩組患者腫瘤組織中抗凋亡基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

治療前觀察組患者腫瘤組織中Caspase-3、p16、Bax基因的mRNA含量及相關(guān)蛋白含量與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；治療后觀察組則均高于對(duì)照組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 治療前后兩組患者腫瘤組織促凋亡基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

3 討論

熱療是新近發(fā)展起來(lái)的大腸癌治療方式，通過(guò)提高局部組織的溫度來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞。與正常組織相比較，腫瘤組織的血管形態(tài)和結(jié)構(gòu)均存在差異，且局部溫度也存在5～10℃的溫差[3]；同時(shí)，腫瘤組織局部乳酸堆積、pH值較低，對(duì)于熱能較為敏感。這就使得局部組織加溫到40～46℃時(shí)，腫瘤細(xì)胞能夠被殺死，而正常組織和細(xì)胞不發(fā)生損傷[4]。熱療可以針對(duì)不同體積病灶發(fā)揮相同的作用，同時(shí)殺滅腫瘤組織較大病灶和微小病灶內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，最大限度的預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究已經(jīng)證實(shí)，術(shù)前射頻熱療能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但具體分子機(jī)制仍未闡明[5-6]。腫瘤局部微血管網(wǎng)極為豐富，可以為細(xì)胞的增殖提供充分的養(yǎng)分；而且腫瘤病灶本身可以通過(guò)分泌大量細(xì)胞因子來(lái)直接介導(dǎo)局部新生血管的形成，這也是結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)最重要的原因。本研究對(duì)結(jié)腸癌患者治療后的MVD進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示觀察組患者腫瘤組織中MVD低于對(duì)照組，這就說(shuō)明術(shù)前射頻熱療有助于降低腫瘤組織局部的MVD，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在血供充足的前提條件下，細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程受到一系列基因的調(diào)控。野生型p53基因是體內(nèi)十分重要的凋亡調(diào)控基因，可以抑制細(xì)胞的增殖過(guò)程；在惡性腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，野生型p53基因發(fā)生突變并導(dǎo)致抑制細(xì)胞增殖能力的喪失，進(jìn)而造成細(xì)胞惡性增殖的發(fā)生[7]。現(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中p53基因均存在突變，突變型p53基因也被視作抗凋亡基因，該基因表達(dá)量越高、腫瘤細(xì)胞的惡性增殖能力越強(qiáng)[8]。Bcl-2是一類(lèi)定位于線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的凋亡調(diào)節(jié)基因，受到PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控，通過(guò)形成同源二聚體的形式發(fā)揮延長(zhǎng)細(xì)胞生命周期、拮抗凋亡誘導(dǎo)因素的功能[9]。CDC25A是雙重特異性磷酸酶家族的成員之一，能夠作用于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）并使之發(fā)生去磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期[10]。目前研究認(rèn)為，在結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中CDC25A呈高表達(dá)狀態(tài)，且與患者的預(yù)后情況密切相關(guān)[11-12]。本研究通過(guò)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)了抗凋亡基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果提示治療后觀察組患者腫瘤組織中突變型p53基因以及CDC25A、Bcl-2的mRNA含量及蛋白含量均低于對(duì)照組。這就說(shuō)明術(shù)前射頻熱療有助于抑制抗凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

除了上述抗凋亡基因外，促凋亡基因同樣也對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。p16基因又稱(chēng)為多腫瘤抑制因子（MTS），具有明確的細(xì)胞增殖抑制活性，直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)比p53更加重要的新型抑癌基因[13]；當(dāng)p16基因丟失后，機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力明顯減弱，細(xì)胞發(fā)生惡性增殖的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[14]。Caspase家族是一類(lèi)蛋白水解酶，包括14種家族成員，直接參與細(xì)胞凋亡的過(guò)程，細(xì)胞凋亡的上游始動(dòng)作用和下游效應(yīng)作用均有不同Caspase家族成員的參與[15]。Caspase-3是凋亡過(guò)程的下游效應(yīng)分子，主要通過(guò)酶切DNA依賴(lài)性蛋白激酶、固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白等特異性底物來(lái)參與細(xì)胞凋亡[16]。Bax是與Bcl-2具有極高的同源性的蛋白，功能卻截然相反；能夠與Bcl-2形成異源二聚體，從而抑制同源二聚體的形成來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。本研究通過(guò)Realtime PCR和Western blot的方法檢測(cè)了抗凋亡基因的表達(dá)情況，結(jié)果提示治療后觀察組患者腫瘤組織中Caspase-3、p16、Bax的mRNA含量和蛋白含量均高于對(duì)照組。這就說(shuō)明術(shù)前射頻熱療有助于上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，術(shù)前射頻熱療聯(lián)合FOLFOX輔助治療有助于降低結(jié)腸癌組織中的MVD，同時(shí)上調(diào)促凋亡分子、抑制抗凋亡分子的表達(dá)，對(duì)于消除結(jié)腸癌術(shù)后微小病灶，減少患者術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有積極的意義。

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Effect of preoperative radio-frequency thermotherapy combined with FOLFOX adjuvant treatment on microvessel density and expression apoptosis-related molecules in colon carcinoma

FU Quanhang.Department of Surgical Oncology,Dongyang People's Hospital, Dongyang 322100,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of preoperative radio-frequency thermotherapy combined with FOLFOX adjuvant treatment on microvessel density(MVD)and expression of apoptosis-related molecules in colon carcinoma. Methods One hundred and twenty patients with colon cancer treated in our hospital from 2013 January to 2014 June were enrolled and randomly divided into two groups.Patients in study group received preoperative radio-frequency thermotherapy combined with FOLFOX chemotherapy before surgery,those in control group received FOLFOX chemotherapy only.Microvessel density of tumor tissue were assayed by immunohistochemical staining,the mRNA and protein expressions of apoptosis-related molecules in tumor tissue were assayed by Real-time PCR and Western blot respectively. Results MVD in study group was lower than that in control group(P＜0.05).The mRNA and protein expressions of pro-apoptotic molecules Caspase-3,p16 and Bax in tumor tissue of study group were higher than those of control group(P＜0.05).The mRNA and protein expression of anti-apoptotic molecules p53,CDC25A and Bcl-2 in tumor tissue of study group were lower than those of control group(P＜0.05). Conclusion Preoperative radio-frequency thermotherapy combined with FOLFOX adjuvant treatment may reduce microvessel density,up-regulate pro-apoptotic molecules expression,and down-regulate anti-apoptotic molecules expression in colon cancer.

Colon cancerRadio-frequency thermotherapy Microvesseldensity Apoptosis Apoptosis gene

2015-09-18）

（本文編輯：田云鵬）

322100 東陽(yáng)市人民醫(yī)院腫瘤外科