謝建平 王趙偉 吳承龍

不同劑量富氫氣生理鹽水對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的治療作用觀察

謝建平 王趙偉 吳承龍

目的 探討富氫氣生理鹽水對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠的治療作用及最佳劑量范圍。方法用豚鼠脊髓勻漿與完全弗氏佐劑免疫SD大鼠制作EAE模型；造模成功后第1～20天大鼠腹腔注射不同劑量（0、3、6ml/kg）富氫氣生理鹽水，觀察并記錄大鼠體重、行為學(xué)評(píng)分；第21天處死大鼠取腦、脊髓作HE染色，檢測(cè)脊髓IL-17、INF-γ表達(dá)水平以及血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果6ml/kg富氫氣生理鹽水劑量組臨床發(fā)病率較低，僅為30．0%；且發(fā)病后能抑制體重下降，最高臨床評(píng)分與累積臨床評(píng)分均最低，中樞組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最少。3、6ml/kg劑量的富氫氣生理鹽水均能抑制EAE大鼠IL-17、INF-γ的釋放，提高SOD活性；但6 ml/kg劑量效果更佳。結(jié)論6ml/kg劑量的富氫氣生理鹽水可能對(duì)降低EAE大鼠臨床發(fā)病率有積極作用，且能抑制發(fā)病大鼠體重下降，降低神經(jīng)缺損行為學(xué)評(píng)分，并能促進(jìn)SOD活性，從而抑制EAE。

氫氣 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 SOD IL-17 INF-γ

氫元素在地球豐度頗高，且具有較強(qiáng)的還原性，因此廣泛應(yīng)用于新能源電池開發(fā)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，氫氣可在人體腸道內(nèi)由細(xì)菌代謝產(chǎn)生，并廣泛存在于內(nèi)環(huán)境中，可選擇性清除羥自由基和過氧亞硝基陰離子而具有抗氧化應(yīng)激與抗細(xì)胞凋亡的作用[1]。此外，富氫氣生理鹽水可以抑制腦、心、肝、腎、肺等臟器的缺血再灌注損傷[2-3]，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病也有一定的治療作用[4]。多發(fā)性硬化是一種慢性炎癥性脫髓鞘性自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致進(jìn)行性神經(jīng)損害與殘疾[5]，發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、易感人群及受到環(huán)境因素影響而導(dǎo)致免疫耐受平衡紊亂有關(guān)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）動(dòng)物模型是人類多發(fā)性硬化的理想動(dòng)物模型，它們有相似的臨床表現(xiàn)、免疫特性及組織病理學(xué)特征[6]。神經(jīng)源性抗原免疫誘導(dǎo)EAE后，可觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與髓鞘脫失；還會(huì)出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抗原特異性Th1、Th17淋巴細(xì)胞增殖、局限性的炎癥反應(yīng)、髓鞘脫失和神經(jīng)壞死等[7]。在脫髓鞘疾病免疫攻擊階段，大量免疫細(xì)胞被活化并釋放炎癥介質(zhì)，存在著氧化應(yīng)激、釋放氧自由基過程，而氫氣能否抑制這一過程尚未明確。本研究通過制作EAE大鼠模型并在其腹腔內(nèi)注射不同劑量富氫氣生理鹽水，觀察大鼠的體重與行為學(xué)改變，脊髓組織病理變化，IL-17、INF-γ表達(dá)及血清超氧化物歧化酶（SOD）活性改變，以探討富氫氣生理鹽水對(duì)EAE是否有治療作用及最佳治療劑量范圍。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 富氫氣生理鹽水（上海第二軍醫(yī)大學(xué)潛水醫(yī)學(xué)教研室），IL-17與INF-γ酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（MIF00、M1700，美國(guó)安迪生物科技有限公司），完全弗氏佐劑（F5881-10X10ML，美國(guó)Sigma-Aldrich公司），百日咳毒素與卡介苗（中國(guó)食品藥品檢定研究院），總蛋白定量測(cè)定試劑盒與超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒（A045-3-96T，南京建成生物工程研究所）；酶標(biāo)儀（684，美國(guó)BIO-RAD公司），可見分光光度計(jì)（722，上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與EAE模型制作 180～200g白色豚鼠17只，用于制作脊髓勻漿；8周齡220～250g且造模成功的SD大鼠（清潔級(jí)）35只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。EAE模型制作參照以往操作流程[8]，主要步驟包括：用注射器來(lái)回抽打豚鼠脊髓勻漿和完全弗氏佐劑（CFA，1∶1體積）成油包水乳劑，皮下注射于大鼠四肢足墊（0.4ml/只）；注射當(dāng)天與之后48h，腹腔注射百日咳毒素1ml（1×109菌體）。CFA組用生理鹽水代替豚鼠脊髓勻漿，再與CFA等體積混勻?yàn)槿閯┖笞⑸溆诖笫笏闹銐|，百日咳毒素處理與EAE組一致。大鼠尾部或肢體出現(xiàn)無(wú)力表示造模成功，成模率為76.7%。

1.3 模型分組及對(duì)照治療 將造模成功的35只大鼠隨機(jī)分為4組：CFA對(duì)照組5只，僅于大鼠足底皮下注射CFA；EAE對(duì)照組10只，造模成功后第1～20天每日腹腔注射生理鹽水；3ml/kg富氫氣生理鹽水治療組10只，造模成功后第1～20天每日腹腔注射3ml/kg富氫氣生理鹽水；6ml/kg富氫氣生理鹽水治療組10只，造模成功后第1～20天每日腹腔注射6ml/kg富氫氣生理鹽水。

1.4 行為學(xué)評(píng)價(jià) 行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)有臨床發(fā)病率、最高臨床評(píng)分和累積臨床評(píng)分。臨床評(píng)分依據(jù)Kono等[9]報(bào)道的行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)明顯異常為0分，尾巴無(wú)力為1分，輕微后肢無(wú)力為2分，嚴(yán)重后肢麻痹為3分，四肢麻痹為4分，瀕死或死亡為5分。

1.5 大鼠標(biāo)本處理 造模成功后第20天將4組大鼠用10%水合氯醛麻醉后統(tǒng)一處死；取其腦和脊髓在4%多聚甲醛中固定24h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟制成蠟塊，切片后用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。部分脊髓組織立即凍存于液氮，并轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存，用于炎癥介質(zhì)檢測(cè)。處死前，尾靜脈抽取血液標(biāo)本，經(jīng)離心（500g）獲得血漿，凍存于-70℃冰箱，用于SOD檢測(cè)。

1.6 血漿SOD檢測(cè) 冰凍血漿經(jīng)融化達(dá)到室溫后，采用黃嘌呤氧化酶法進(jìn)行SOD活性檢測(cè)：在測(cè)定管分別加入試劑一1ml、血漿0.1ml、試劑二0.1ml、試劑三0.1ml、試劑四0.1ml；在對(duì)照管分別加入試劑一1ml、雙蒸水0.1ml、試劑二0.1ml、試劑三0.1ml、試劑四0.1ml；經(jīng)旋窩混勻器混勻后于37℃恒溫水浴40min，加入顯色劑2ml，室溫靜置10min，選擇550nm波長(zhǎng)、1cm光徑比色杯，經(jīng)蒸餾水調(diào)零后，上機(jī)檢測(cè)吸光度值；根據(jù)吸光度值換算獲得SOD活性值。

1.7 脊髓IL-17與INF-γ表達(dá)水平檢測(cè) （1）脊髓勻漿上清液總蛋白濃度測(cè)定：保存于-70℃冰箱的脊髓組織經(jīng)室溫解凍后，立刻在細(xì)胞裂解液中勻漿；取標(biāo)準(zhǔn)品與組織上清液稀釋、加樣，37℃溫浴30min，加終止液混勻5min；選擇562nm波長(zhǎng)上機(jī)檢測(cè)各管吸光度值，根據(jù)吸光度擬核標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各樣品總蛋白濃度。（2）ELISA法檢測(cè)IL-17與INF-γ濃度：試劑盒及脊髓勻漿液標(biāo)本靜置達(dá)室溫后，用移液器添加50μl稀釋液到酶標(biāo)板各孔內(nèi)，分別添加標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照液、血漿樣品50μl到相應(yīng)各孔內(nèi)，酶標(biāo)板覆蓋塑料蓋板后室溫孵育2 h，甩干各孔并洗滌5次，加入100μl偶聯(lián)化合物至各孔，室溫孵育2 h，甩干各孔并洗滌5次，加入100μl底物液后室溫避光孵育30min，加入100μl終止液；選擇450nm波長(zhǎng)（以540nm為對(duì)照波長(zhǎng)）在30min內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)吸光度擬核標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各樣品IL-17與INF-γ濃度；（3）通過IL-17或INF-γ濃度/總蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以表示脊髓IL-17或INF-γ表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，神經(jīng)缺損行為學(xué)評(píng)分、體重等多樣本均數(shù)比較采用方差分析，其余均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化 造模成功后第9天，除CFA組體重增加外，其余3組均出現(xiàn)體重下降；第11～20天，CFA組大鼠體重與其余3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；第18～20天，EAE組大鼠體重均明顯低于6 ml/kg組（均P＜0.05），而與3ml/kg組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠日均體重變化

2.2 大鼠行為學(xué)評(píng)分變化 EAE組大鼠臨床發(fā)病率最高（80.0%），3ml/kg組次之（50.0%），6ml/kg組較低（30.0%）。3ml/kg組、6ml/kg組最高臨床評(píng)分均低于EAE組（均P＜0.05）；而3ml/kg組與6 ml/kg組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模成功后第1～20天累積臨床評(píng)分比較，3ml/kg組、6ml/kg組均低于EAE組（均P＜0.05）；3ml/kg組高于6ml/kg組（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠臨床發(fā)病率及行為學(xué)評(píng)分

2.3 脊髓組織病理檢查結(jié)果 CFA組大鼠脊髓病理切片中未見明顯炎癥反應(yīng)，偶見少量單核細(xì)胞；EAE組可見典型的淋巴袖套形成，數(shù)量較多，脊膜下可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；3ml/kg組可見少量典型的淋巴袖套，炎癥細(xì)胞集中在脊髓膜下；6ml/kg組可見散在的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，分布稀疏，極少見到典型的淋巴袖套，見圖2。

圖2 脊髓組織病理檢查結(jié)果（A：CFA組腰髓，正常脊髓；B：EAE組腰髓，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；C：3ml/kg組腰髓，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；D：6ml/kg組腰髓，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；HE染色，×400）

2.4 造模后各組大鼠血清SOD活性變化 除CFA組外，其余3組大鼠SOD活性在造模后第9、14、19天均明顯下降。與CFA組比較，EAE組大鼠SOD活性在以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均明顯下降（均P＜0.01）；與EAE組比較，3ml/kg組、6ml/kg組SOD活性在以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯升高（均P＜0.01）。6ml/kg組與3ml/kg組大鼠SOD活性比較，第19天6ml/kg組較高（P＜0.05），其余2d差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 造模后各組大鼠血清SOD活性變化（U/ml）

2.5各組大鼠脊髓IL-17與INF-γ表達(dá)水平變化 EAE組炎癥介質(zhì)IL-17與INF-γ表達(dá)水平均高于CFA組（均P＜0.01）；與EAE組比較，6ml/kg組、3ml/kg組大鼠脊髓IL-17、INF-γ表達(dá)水平均明顯下降（均P＜0.05）；6ml/kg組與3ml/kg組的IL-17、INF-γ表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠脊髓IL-17與INF-γ表達(dá)水平

3 討論

多發(fā)性硬化是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有軸突損傷為特點(diǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。EAE模型多發(fā)性硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型，具有相似的免疫學(xué)機(jī)制[9]。通過神經(jīng)源性抗原免疫誘導(dǎo)EAE后，可觀察到中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與髓鞘的脫失。誘導(dǎo)EAE后還會(huì)出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)抗原特異性Th1、Th17淋巴細(xì)胞增殖、局限性的炎癥反應(yīng)、髓鞘脫失和神經(jīng)壞死等。Th1、Th2、Th17和Treg淋巴細(xì)胞則與EAE疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

Treg淋巴細(xì)胞占人類外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞的1%～2%，占CD4+T細(xì)胞的5%～10%。骨髓制造的幼稚T淋巴細(xì)胞可在胸腺發(fā)育成熟；Treg淋巴細(xì)胞也能被TGF-β、致耐受性樹突狀細(xì)胞或特異性抗原持續(xù)刺激所誘導(dǎo)成熟。Treg細(xì)胞在抑制針對(duì)自身抗原的病理性免疫反應(yīng)、感染恢復(fù)與維持免疫穩(wěn)態(tài)等方面具有重要作用。Th1、Th17參與促進(jìn)炎癥過程，并釋放IL-17、INFγ；炎癥細(xì)胞在IL-17、INFγ等介導(dǎo)下最終導(dǎo)致呼吸暴發(fā)，產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，加重中樞炎癥損傷[10]。SOD是生物體內(nèi)最重要的抗自由基活性酶類，其活性很大程度上決定個(gè)體的抗氧化應(yīng)激能力，即體現(xiàn)EAE發(fā)病的抵抗能力。

目前認(rèn)為氫氣對(duì)抗氧化應(yīng)激作用顯著，具有廣泛的應(yīng)用前景[11]。本實(shí)驗(yàn)通過制作EAE模型并腹腔注射富氫氣生理鹽水，從EAE動(dòng)物體重變化、神經(jīng)缺損行為學(xué)評(píng)分、組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果、致病性炎癥介質(zhì)等方面評(píng)價(jià)富氫氣生理鹽水對(duì)EAE的抑制作用，發(fā)現(xiàn)6ml/kg劑量效果最佳。但本研究未使用更高劑量，建議進(jìn)一步研究更大劑量富氫氣生理鹽水是否能達(dá)到更好的治療效果或可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)全程使用富氫生理鹽水可能對(duì)降低大鼠EAE臨床發(fā)病率有積極作用；但本研究樣本量不足，故未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，建議今后擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步研究。我們還發(fā)現(xiàn)富氫氣生理鹽水治療組大鼠發(fā)病過程中血清SOD活性水平明顯升高，其抗氧化應(yīng)激儲(chǔ)備能力明顯增強(qiáng)，可能與氫氣直接中和強(qiáng)自由基和過氧亞硝基陰離子，從而減少了SOD損耗有關(guān)[12]。對(duì)于氫氣是否能直接調(diào)節(jié)SOD活性或促進(jìn)SOD酶蛋白表達(dá)，需進(jìn)一步研究。IL-17、INF-γ是EAE的致病炎癥介質(zhì)之一[13]，本研究發(fā)現(xiàn)氫氣可以抑制IL-17表達(dá)，且可能參與調(diào)節(jié)IL-17表達(dá)或Th17細(xì)胞活化增殖的信號(hào)通路。

本研究初步認(rèn)為氫氣可以抵抗EAE大鼠中樞炎癥，6 ml/kg劑量的富氫生理鹽水療效較好；氫氣對(duì)EAE治療作用可能與升高SOD水平、抑制IL-17有關(guān)。氫氣抑制IL-17表達(dá)的具體信號(hào)通路、促進(jìn)SOD活性的具體機(jī)制等有待深入研究。

[1] Hong Y,Guo S,Chen S,et al．Beneficial effect of hydrogen-rich saline on cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage in rats[J]．Journal of neuroscience research,2012,90 (8):1670-1680．

[2] Kawamura T,Huang C S,Tochigi N,et al．Inhaled hydrogen gas therapy for prevention of lung transplant-induced ischemia/reperfusion injury in rats[J]．Transplantation,2010,90(12):1344-1351．

[3] Zhang Y,Sun Q,He B,et al．Anti-inflammatory effect of hydrogen-rich saline in a rat model of regional myocardial ischemia and reperfusion[J]．International journal of cardiology,2011,148(1): 91-95．

[4] Xue X,Bian J S．Neuroprotective effects of hydrogen sulfide in Parkinson's disease animal models:methods and protocols[J]．Methods in enzymology,2015,554:169-186．

[5] McWilliams I L,Rajbhandari R,Nozell S,et al．STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE[J]．Journal of neuroinflammation,2015,12:128．

[6] 王沛,鄭榮遠(yuǎn),林福虹,等．實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦組織和脊髓中腦型肌酸激酶、鈣泵和鈣中性蛋白酶的變化[J]．中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué),2011,19(1):9-15．

[7] Kurschus F C．T cell mediated pathogenesis in EAE:Molecular mechanisms[J]．Biomedical journal,2015,38:183-193．

[8] 王趙偉,鄭榮遠(yuǎn),林福虹,等．左旋咪唑通過促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞MHC-Ⅱ表達(dá)而加重實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎[J]．中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué), 2011,19(1):1-4．

[9] Kono D H,Urban J L,Horvath S J,et al．Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice[J]．The Journal of experimental medicine, 1988,168(1):213-227．

[10] Okuda Y,Sakoda S,Fujimura H,et al．IL-6 plays a crucial role in the induction phase of myelin oligodendrocyte glucoprotein 35-55 induced experimental autoimmune encephalomyelitis[J]．J Neuroimmunol,1999,101(2):188-196．

[11] Chang W J,Toledo-Pereyra L H．The potential benefits of hydrogen-rich saline in ischemia and reperfusion injury[J]．The Journal of surgical research,2013,180:248-249．

[12] Nakao A,Kaczorowski D J,Wang Y,et al．Amelioration of rat cardiac cold ischemia/reperfusion injury with inhaled hydrogen or carbon monoxide,or both[J]．The Journal of Heart and Lung Transplantation,2010,29(5):544-553．

[13] Zielinski C E,Mele F,Aschenbrenner D,et al．Pathogen-induced human TH17 cells produce IFN-γ or IL-10 and are regulated by IL-1β[J]．Nature,2012,484(7395):514-518．

Effects of hydrogen-rich saline against experimental autoimmune encephalomyelitis in SD rats

XIE Jianping. WANG Zhaowei. WU Chenglong. Department of Neurology. Shaoxing People's Hospital. Shaoxing 312000. China

Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)．MethodsEAE was induced by injection of spinal cord homogenate of guinea pig with complete Freund's adjuvant(CFA) in SD rats．From the 1st day to the 20th day after EAE induced,the rats received peritoneal injection of hydrogen-rich saline(0,3, 6ml/kg)．On the 21th day,all rats were sacrificed;paraffin sections of spine cord were prepared and stained with hematoxylin-eosin to detect inflammatory cell infiltration．The expression of IL-17 and INF-γin the spinal cord was determined by ELISA and serum SOD activity was determined on the 10th,15th and 20th after EAE induced．ResultsThe incidence of EAE in hydrogen-rich saline 6ml/kg group was lowest(30．0%)among 3 groups．Hydrogen-rich saline 6ml/kg inhibited the weight reduction and reduced the neurobehavioral deficits scores．It also reduced the inflammatory cell infiltration in the spinal cord of EAE rats and the expression of IL-17 and INF-γ,while increased the level of SOD．The degree of weight reduction was not reduced by given 3ml/kg hydrogen-rich saline,while it reduced the neurobehavioral deficits scores and the inflammatory cell infiltration in spinal cord and the expression of IL-17 and INF-γand up-regulated the SOD level．ConclusionHydrogen-rich saline can reduce the severity of EAE,which may be associated with its antioxidant effect and the up-regulation of serum SOD．

Hydrogen Experimental autoimmune encephalomyelitis SOD IL-17 INF-γ

2015-11-30）

（本文編輯：陳丹）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2015ZHB014）

312000 紹興市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

吳承龍，E-mail：wuchlo7666@126.com