汪寧 鐘歡 陳曉農 湯建兒 陳煜 高建國 王榮江

CML66在腎癌組織中的表達及其臨床意義

汪寧 鐘歡 陳曉農 湯建兒 陳煜 高建國 王榮江

目的 探究慢性粒細胞白血病腫瘤抗原66（CML66）在腎腫瘤組織中的表達及其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測155例腎癌組織及其癌旁正常腎臟組織、36例腎血管平滑肌脂肪瘤組織中CML66蛋白的表達，分別比較腎癌組織與癌旁正常腎臟組織、腎血管平滑肌脂肪瘤組織的CML66陽性表達率，并分析腎癌組織CML66陽性表達率與臨床特征的關系。結果腎癌組織中CML66陽性表達率為83．9%，明顯高于癌旁正常腎臟組織的35．5%（P＜0．05）；但與腎血管平滑肌脂肪瘤組織的80．6%比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。腎癌組織病理分級Ⅲ、Ⅳ級，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66陽性表達率均分別高于Ⅰ、Ⅱ級/期，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結論CML66在腎癌組織中高表達有助于明確診斷，可作為評估腎癌病理分級、臨床分期的指標，可能對腎癌術后輔助治療有一定的參考價值。

慢性粒細胞白血病腫瘤抗原66 腎癌 免疫組化

目前腎癌的治療方式仍以根治性手術為主，腎癌對放化療不敏感，出現轉移后預后較差，因此尋找敏感的腎癌標志物以早期發(fā)現腫瘤與判斷患者預后，從而指導個體化治療具有重要臨床意義。慢性粒細胞白血病腫瘤抗原66（CML66）是一種廣譜腫瘤抗原或癌基因。最早它是通過重組cDNA表達文庫血清分析技術從慢性粒細胞性白血病患者血清中篩選出來的一種具有廣泛免疫原性的腫瘤抗原，相對分子質量為66kDa，在人類染色體中位于8q 23.3，除了在慢性粒細胞性白血病中高表達，還表達于肺癌、黑色素瘤、前列腺癌組織及瘤細胞株。本實驗采用免疫組化法檢測腎癌組織中CML66的表達，分別與癌旁正常腎臟組織、腎血管平滑肌脂肪瘤組織進行比較，并探討腎癌組織CML66陽性表達率與臨床特征的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 以2009年4月至2014年4月湖州師范學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科手術切除的155例腎癌組織及距離腫瘤邊緣4cm以上的正常腎臟組織、36例腎血管平滑肌脂肪瘤組織為研究對象，均經病理證實。腎癌患者中男89例，女66例；年齡33～83歲，平均（58.9± 11.6）歲；透明細胞癌60例，腎盂尿路上皮癌24例，嫌色細胞癌15例，乳頭狀癌10例，嗜酸細胞癌13例，混合癌9例，腺癌11例，囊性腎癌13例；左側75例，右側80例；采用1997年WHO分級系統(tǒng)進行病理分級：Ⅰ、Ⅱ級83例，Ⅲ、Ⅳ級72例；采用2009年AJCC腎癌分期系統(tǒng)進行臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期97例，Ⅲ、Ⅳ期58例。所有腎癌患者手術前均未發(fā)生遠處轉移，均無其他惡性腫瘤病史，術前均未接受過放化療或免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 CML66多克隆抗體購自英國Abcam公司；山羊血清、兔超敏免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋生物科技有限公司。

1.2.2 標本采集 所有標本經10%甲醛固定，石蠟包埋常規(guī)脫水，每個石蠟切片選取最佳切取部位切片3～4張，制成厚4μm，HE染色。

1.2.3 免疫組化 切片組織滴加一抗CML66（1∶1 000），孵育、清洗，滴加二抗孵育、清洗、DAB顯色、終止反應、蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察、拍照。以已知腎腫瘤標本切片作為陽性對照，以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.2.4 結果判定 CML66陽性染色主要定位于腎實質細胞的胞質，根據陽性細胞染色強度及其所占實質細胞的百分比進行半定量結果判斷：（1）先根據陽性細胞染色強度評分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；（2）每張切片上觀察5個視野（×100），再根據陽性細胞數所占實質細胞的百分比評分：陰性0分，＜10%為1分，10%～為2分，50%～為3分，≥75%為4分。以上2項評分結果相乘所得為陽性等級：0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++）；9～12分為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 CML66在腎癌組織及其癌旁正常腎臟組織中的表達 CML66在腎透明細胞癌中呈陽性表達，見圖1；在癌旁正常腎臟組織中呈陰性或弱陽性表達，見圖2。CML66蛋白主要定位于腎實質細胞的胞質，其中腎小管、集合管呈陽性表達，腎小球呈陰性表達。

圖1 CML66在腎透明細胞癌中的表達（HE染色，×100）

圖2 CML66在癌旁正常腎臟組織中的表達（HE染色，×100）

2.2 腎癌組織與癌旁正常腎臟組織中CML66陽性表達率的比較 腎癌組織中CML66陽性表達率為83.9%，明顯高于癌旁正常腎臟組織的35.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 腎癌組織與癌旁正常腎臟組織中CML66陽性表達率的比較[例（%）]

2.3 腎癌組織與腎血管平滑肌脂肪瘤組織CML66陽性表達率的比較 腎血管平滑肌脂肪瘤組織中CML66陽性表達率為80.6%（29/36），與腎癌組織（83.9%）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 腎癌組織中CML66陽性表達率與臨床特征的關系 腎癌組織病理分級Ⅲ、Ⅳ級，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66陽性表達率均分別高于Ⅰ、Ⅱ級/期，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

基因序列分析發(fā)現，線蟲、果蠅和小鼠均有與CML66基因同源的序列存在，特別是在小鼠睪丸中發(fā)現的序列，其同源性高達92%。諾瑟雜交法檢測結果表明，CML66在人體睪丸正常組織中高表達、心臟略有表達，其余均不表達，因此被認為是一種廣譜腫瘤抗原或癌基因[1]。重組cDNA表達文庫血清學分析篩選卵巢癌文庫時發(fā)現卵巢癌患者中存在CML66抗體，原核表達CML66蛋白，ELISA、Western blot和斑點印跡檢測結果均為腫瘤患者CML66血清水平明顯高于正常人。本次研究顯示，CML66在癌旁正常腎臟組織中呈陰性或弱陽性表達，而在腎癌組織中呈陽性表達；這提示CMLL66作為一種癌基因，參與腎癌的發(fā)生、發(fā)展。CML66在腎血管平滑肌脂肪瘤與腎癌組織中的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義；這提示CML66不能作為區(qū)別腎臟良惡性變的敏感性指標。Wang等[2]采用RNA干擾技術低表達CML66，導致宮頸癌Hela細胞失去增殖、侵襲和轉移能力；這提示CML66不僅是一種腫瘤抗原標志物，還可能作為一種癌基因直接調控腫瘤進展。有研究發(fā)現CML66具有免疫原性，在相關腫瘤患者血清中可測到其相應抗體，因此可作為相關腫瘤免疫診斷與治療的指標[1]。

表2 腎癌組織中CML66陽性表達率與臨床特征的關系[例（%）]

CML66作為原癌基因，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。相關研究發(fā)現CML66可與LIS1和Dynein形成復合體，參與由Dynein介導的染色體分離和胞質分裂[3-5]；RNAi介導的CML66表達下調，導致多種形態(tài)的異常細胞分裂，如細胞分裂中期染色體的異常排列、細胞出現多個分裂極、出現多核細胞[3-4]，而這正是腫瘤早期發(fā)生的細胞內部結構變化。本研究結果顯示，CML66在腎癌組織中高表達，與病理分級、臨床分期有關，腎癌組織病理分級Ⅲ、Ⅳ級，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期的CML66陽性表達率均分別高于Ⅰ、Ⅱ級/期；這提示高表達CML66可能促進腎癌細胞浸潤，其表達程度可能可以預測腎癌預后。2項基因芯片篩查發(fā)現CML66基因在肺癌原發(fā)灶[6]和肺癌骨微轉移灶[7]中上調，提示CML66可作為腫瘤早期和早期微轉移的評估指標。表2提示腎癌組織中CML66陽性表達率與淋巴結轉移無關，可能與本研究淋巴結轉移例數偏少有關。

本研究推測，隨著腎癌病理分級、臨床分期的提高，CML66蛋白表達量不斷增加，且參與細胞惡性演變過程。但CML66在腎血管平滑肌脂肪瘤中亦呈陽性表達，因此有必要擴大樣本量并進一步研究CML66在腎癌中上調的遺傳學機制、對腎癌細胞生物學行為的影響以及具體信號通路，以期為腎癌的早期診斷和治療提供新的分子靶標。

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Expression of CML66 in renal carcinoma and its clinical significance

WANG Ning. ZHONG Huan. CHEN Xiaonong. et al. Department of Urology. the First Affiliated Hospital of Huzhou Normal College. Huzhou 313000. China

Objective To investigate the expression of CML66 in renal carcinoma and its clinical significance．MethodsThe expression of CML66 in 155 samples of renal cell carcinoma and its adjacent normal tissue and 36 samples of renal angiomyolipoma were detected by immunohistochemical method．The relationship between CML66 expression and clinical charactenristics of renal cell carcinorma was analyzed．ResultsThe positive expression rates of CML66 in renal cell carcinoma was 83．9%,significantly higher than the adjacent normal renal tissue(P＜0．05),but there was no significant difference in CML66 expression between renal cell carcinoma and renal angiomyolipoma(P＞0．05)．The positive expression rates of CML66 in renal cell carcinoma of pathological grade and clinical stagesⅢ/Ⅳwere significantly higher than those in gradeⅠ/Ⅱrenal carcinoma (P＜0．05)．ConclusionOverexpression of CML66 may be used as an indicator for diagnosis of renal cell carcinoma and evaluation of pathological grade and clinical stages．

CML66 Renal tumorImmunohistochemical method

2016-02-25）

（本文編輯：陳丹）

湖州市科技局公益性重點項目（2014GZB03）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃骨干人才項目（2016RCB019）

313000 湖州師范學院附屬第一醫(yī)院泌尿外科

王榮江，E-mail：wn6530289162@163.com