何永禮 施福田 嚴(yán)秋亮 朱錦輝

Aurora-A表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究

何永禮 施福田 嚴(yán)秋亮 朱錦輝

目的 探討Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥之間的關(guān)系。方法 40只裸鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，分別采用人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和吉西他濱耐藥株P(guān)ANC-1/R2皮下移植再原位移植的方法構(gòu)建動(dòng)物模型（PANC-1組、PANC-1/R2組）。采用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增（qPCR）法測(cè)定PANC-1和PANC-1/R2中Aurora-AmRNA的表達(dá)。建模后第5周處死裸鼠，測(cè)定并比較兩組裸鼠體重、腫瘤轉(zhuǎn)移情況、腫瘤質(zhì)量；采用免疫組化方法測(cè)定并比較兩組瘤體Aurora-A蛋白的表達(dá)。結(jié)果PANC-1組、PANC-1/R2組第5周裸鼠體重、腫瘤重量及腫瘤轉(zhuǎn)移率分別為（23.2±1.41）g、（0.453±0.110）g、36.8%及（22.91± 1.13）g、（0.564±0.203）g、50.0%，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），兩組Aurora-A mRNA表達(dá)分別為1.002±0.040及1.845±0.069，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組Aurora-A蛋白陽性表達(dá)率分別為83.3%及57.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 Aurora-A高表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞株的吉西他濱耐藥有關(guān)，新方法構(gòu)建的PANC-1/R2耐藥株Aurora-A高表達(dá)，可用于胰腺癌吉西他濱耐藥研究的載體。

Aurora-A 胰腺癌 多藥耐藥 吉西他濱

【 Abstract】 Objective To assess the relationship of Aurora-A expression with gemcitabine-resistance in pancreatic cancer cells. Methods Pancreatic cancer model was established by inoculation in nude mice with human pancreatic cancer PANC-1 cells and drug resistant pancreatic cancer PANC-1/R2 cells,respectively(n=20 in each group).The expression of Aurora-A mRNA in PANC-1 and PANC-1/R2 cells were tested by qPCR technique.Animals were sacrificed after 35d and the tumor tissue samples were collected.The expression of Aurora-A protein in tumor tissues of two groups was detected by immunohistochemistry. Results In PANC-1 and PANC-1/R2 groups,the metastatic rate in 5 ws was 36.8%(7/19)and 50.0% (9/18)(χ2=4.21,P＜0.05),the mean weight of tumor was 0.453±0.110g and 0.564±0.203g(t=9.35,P＜0.05),the weight of mice was 23.2±1.41 g and 22.91±1.13g(t=20.36, P＜0.05).The expression of Aurora-A mRNA in PANC-1 cells and in PANC-1/R2 cells was 1.002± 0.040 and 1.845± 0.069,respectively(t=35.02,P＜0.05).Positive expression of Aurora-A protein was detected in 15 out 18 mice of PANC-1/R2 group,while it was in 11 out 19 mice of PANC-1 group(χ2=5.023,P＜0.05). Conclusion High expression of Aurora-A gene is associated with gemcitabine-resistance in pancreatic cancer cells.

胰腺癌是常見的病死率很高的惡性腫瘤，化療效果不理想。作為治療胰腺癌的首選藥物吉西他濱，其化療有效率也僅為25%[1]，多藥耐藥是導(dǎo)致化療效果欠佳的重要原因。Aurora-A蛋白作為DNA修復(fù)功能的蛋白，具有參與修復(fù)DNA的作用。目前發(fā)現(xiàn)，在食管癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等的化療中，抑制Aurora-A的表達(dá)能增強(qiáng)腫瘤的化療敏感度[2-4]。本文采用人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和吉西他濱耐藥株P(guān)ANC-1/R2細(xì)胞株皮下移植再原位移植的方法構(gòu)建動(dòng)物模型，以此研究Aurora-A差異表達(dá)與吉西他濱的耐藥關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：40只雄性BALB/c裸小鼠由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，鼠齡42～56（47± 12）d；質(zhì)量18～20（19.2±0.7）g；飼養(yǎng)于恒溫（25～27℃）、恒濕（45%～50%），且符合無特定病原體條件的裸鼠室內(nèi)；飲用水及標(biāo)準(zhǔn)食療均經(jīng)滅菌后供動(dòng)物自由食用。（2）細(xì)胞株：PANC-1由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科研究所提供。PANC-1/R2為體外培養(yǎng)體內(nèi)誘導(dǎo)循環(huán)篩選的新方法獲得的PANC-1的吉西他濱耐藥株。（3）主要儀器和試劑：實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增（qPCR）儀購自Biorad公司，IS1000凝膠成像系統(tǒng)購自美國法莫西亞公司，Beckman Coul ter Avanti J-20低溫離心機(jī)購自德國Heraeus公司，鼠抗人Aurora-A單克隆抗體購自美國Santa Crus Biotechnology公司，Taq DNA聚合酶購自日本Takara公司，RNA酶抑制劑購自美國Promega公司，ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒購自華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 將40只裸小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分成兩組，每組20只，分別用PANC-1和PANC-1/R2兩種細(xì)胞株皮下移植再原位移植的方法建模（即PANC-1組及PANC-1/R2組）。兩組裸鼠每天檢查、每周稱重，于建模后第5周稱重后處死。實(shí)驗(yàn)過程中，PANC-1組術(shù)后1周因腹腔感染死亡1只，故PANC-1組19只進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，PANC-1/R2組術(shù)后10d及2周時(shí)因腹腔感染各死亡1只，故18只進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收集兩組裸鼠腫瘤病灶及淋巴結(jié)和內(nèi)臟等標(biāo)本組織。胰腺腫瘤組織在拭干表面水分后立即在電子稱上稱重并記錄。標(biāo)記取下后的標(biāo)本，用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗，并取腫瘤組織1塊（用于免疫組化染色）立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。其余腫瘤組織石蠟包埋切片進(jìn)行HE染色。所有腫瘤組織均作病理切片證實(shí)。記錄兩組裸鼠重量、腫瘤組織重量，以及胰腺外淋巴、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，并進(jìn)行組間比較。

1.2.2 Aurora-A mRNA測(cè)定 PANC-1和PANC-1/R2兩種細(xì)胞株作體外培養(yǎng)，細(xì)胞裂解提取RNA，以提取的RNA進(jìn)行擴(kuò)增。其引物序列及目的片段的長度Aurora-A-R為CGGTTCAGAATCAGAAGCAGAAGC（5′-3′）；Aurora-A-F為CCAGAGGGCGACCAATTTCAAAG（5′-3′）。qPCR程序：將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，設(shè)定程序?yàn)閮刹椒╮eal-time PCR，預(yù)變性95℃，1min；之后每一步變性95℃，5s；退火延伸60℃，20s；共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，選擇明亮條帶的產(chǎn)物進(jìn)行正反向測(cè)序，電壓設(shè)定120V，電流60mA，然后在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上成像觀察擴(kuò)增結(jié)果。記錄兩組qPCR測(cè)定的mRNA的結(jié)果，并進(jìn)行組間比較。

1.2.3 Aurora-A蛋白表達(dá)測(cè)定 采用二步法免疫組化測(cè)定Aurora-A蛋白表達(dá)。免疫組化染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。Aurora-A蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。在光學(xué)顯微鏡下觀察全片，對(duì)切片染色陽性情況進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果判定參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。顯微鏡下取不同放大倍數(shù)，選取5個(gè)高倍視野，拍照、保存結(jié)果。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量、百分率及表達(dá)強(qiáng)度分為4級(jí)：0級(jí)為無明顯陽性反應(yīng)細(xì)胞，Ⅰ級(jí)為陽性細(xì)胞＜25%、弱染色，Ⅱ級(jí)為陽性細(xì)胞25%～75%；Ⅲ級(jí)為陽性細(xì)胞＞75%、強(qiáng)染色。0～Ⅰ級(jí)判為陰性表達(dá)；Ⅱ～Ⅲ級(jí)判為陽性表達(dá)。分別記錄兩組免疫組化Aurora-A蛋白表達(dá)的陽性率，并進(jìn)行比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠第5周體重、腫瘤質(zhì)量及胰腺外淋巴、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率比較 見表1。

表1 兩組第5周裸鼠體重、腫瘤質(zhì)量及胰腺外淋巴、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率比較

2.2 兩種細(xì)胞株Aurora-A mRNA表達(dá)水平的比較PANC-1、PANC-1/R2細(xì)胞株Aurora-A mRNA的表達(dá)水平分別為1.002±0.040及1.845±0.069，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=35.02，P＜0.05）。其電泳圖見圖1。

2.3 兩組裸鼠標(biāo)本中Aurora-A蛋白表達(dá)情況 PANC-1、PANC-1/R2標(biāo)本中Aurora-A蛋白表達(dá)陽性率分別為57.9%（11/19）、83.3%（15/18），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.023，P＜0.05）。光學(xué)顯微鏡下可見Aurora-A蛋白陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒，主要分布在腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖2）。

3 討論

Aurora-A是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)中心體、微管功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在中心體成熟、紡錘體形成、染色體分離，即有絲分裂的正常進(jìn)行中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。目前，Aurora-A已被認(rèn)為是一個(gè)與多種惡性腫瘤發(fā)生相關(guān)的癌基因。當(dāng)前眾多研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A在乳腺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)[5-6]，其表達(dá)水平與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和患者預(yù)后具有相關(guān)性[7]。抑制Aurora-A活性，可有效地阻礙細(xì)胞的生長、增殖，并引起腫瘤細(xì)胞的凋亡[8]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞面對(duì)化療藥物的作用下出現(xiàn)DNA的損傷時(shí)，Aurora-A恰能對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，從而出現(xiàn)耐藥。很多研究表明，Aurora-A的高表達(dá)是產(chǎn)生腫瘤耐藥的重要因素[9-10]。既往的研究著重于Aurora-A的表達(dá)與腫瘤及預(yù)后的關(guān)系，如Sakakura等[11]報(bào)道存在Aurora-A基因擴(kuò)增的原發(fā)性胃癌患者比未發(fā)現(xiàn)Aurora-A基因擴(kuò)增的患者預(yù)后更差。Warner等[12]比較了Aurora-A和Aurora-B作為胰腺癌抗癌治療的分子靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)以Aurora-A為靶點(diǎn)治療可能在有絲分裂停滯和快速誘導(dǎo)程序性死亡方面，優(yōu)于針對(duì)Aurora-B為靶點(diǎn)的治療，但鮮有Aurora-A蛋白表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥關(guān)系的研究，因此本研究通過構(gòu)建耐藥細(xì)胞株及耐藥動(dòng)物模型，并通過該研究平臺(tái)探討Aurora-A蛋白表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥的關(guān)系。

圖1 兩種細(xì)胞株Aurora-A電泳圖[a：標(biāo)記物（Marker）電泳圖，b：分組及對(duì)應(yīng)的目標(biāo)條帶]

圖2 Aurora-A蛋白表達(dá)免疫組化檢測(cè)所見（a：蘇木精染色，× 100；b：蘇木精染色，×400）

PANC-1/R2細(xì)胞株是通過體外培養(yǎng)體內(nèi)誘導(dǎo)方式，循環(huán)2輪后獲得的耐藥細(xì)胞株。用PANC-1、PANC-1/R2細(xì)胞株構(gòu)建胰腺癌模型，發(fā)現(xiàn)PANC-1/R2惡性程度更高，表現(xiàn)為該組的瘤體質(zhì)量更重，裸鼠體重相對(duì)較輕且胰腺癌的轉(zhuǎn)移率明顯較高，提示耐藥的胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)惡性程度也相應(yīng)提高。

通過qPCR技術(shù)檢測(cè)兩組Aurora-A mRNA的表達(dá)，兩組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化測(cè)定蛋白水平的表達(dá)，兩組表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可見蛋白水平和基因水平均證實(shí)Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱的耐藥有關(guān)，具體為耐藥細(xì)胞Aurora-A高表達(dá)，敏感細(xì)胞Aurora-A低表達(dá)，證實(shí)Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥有關(guān)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的情況相符合。

Aurora-A如何參與腫瘤的發(fā)生和耐藥產(chǎn)生，目前有很多觀點(diǎn)。大體上認(rèn)為Aurora-A過表達(dá)能夠在Cdc20-BubR1相互作用的水平上，通過干擾有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)復(fù)合物的恰當(dāng)組裝導(dǎo)致基因不穩(wěn)定和腫瘤生長[1]。目前多藥耐藥的機(jī)制尚不明確，宏觀上講與腫瘤細(xì)胞的自我吞噬增強(qiáng)自身抵抗力以及減少凋亡有關(guān)。Aurora-A參與自噬調(diào)節(jié)的研究不多，但已報(bào)道的研究結(jié)果表明Aurora-A可以通過自噬的途徑誘導(dǎo)腫瘤的耐藥。Zou等[13]研究發(fā)現(xiàn)Aurora-A陽性表達(dá)的乳腺腫瘤組織中自噬相關(guān)蛋白SQSTM1呈現(xiàn)高表達(dá)，該研究通過小分子VX-680或sRNA干擾抑制Aurora-A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和自噬體明顯增加，而SQSTM1明顯降低；而過度表達(dá)Aurora-A則抑制自噬。Aurora-A通過負(fù)向調(diào)節(jié)自噬的途徑發(fā)揮誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞自噬性的凋亡。該研究結(jié)果提示Aurora-A的高表達(dá)抑制自噬，低表達(dá)誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生對(duì)藥物的耐藥，這與本研究結(jié)果不符合，推測(cè)自噬在耐藥產(chǎn)生中并非主導(dǎo)作用。Hamidi等[14]研究表明Nupr1通過調(diào)節(jié)Aurora-A對(duì)抗因缺氧及糖饑餓引起的自噬性的細(xì)胞程序性死亡，提示非DNA損傷性的抗癌藥物耐藥可能與Aurora-A有關(guān)。p53、PP1、Cy clin B1-cdc2、BRCA1、RasGA P、Survivin、c-myc與Aurora-A的相互作用是導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生耐藥的可能原因。可見，Aurora-A參與腫瘤形成及多藥耐藥的機(jī)制研究很多，機(jī)制復(fù)雜，但目前與自噬相關(guān)的較少，而其作用逐步得到認(rèn)識(shí)，具有廣闊的研究前景。

綜上所述，Aurora-A被認(rèn)為與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，本研究結(jié)果顯示PANC-1組免疫組化Aurora-A的陽性表達(dá)與轉(zhuǎn)移率有關(guān)，PANC-1/R2組Aurora-A的陽性表達(dá)與轉(zhuǎn)移率無關(guān)。但兩組間Aurora-A蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示對(duì)于敏感的腫瘤（如PANC-1細(xì)胞株），Aurora-A蛋白表達(dá)與胰腺癌的轉(zhuǎn)移率有關(guān)，但隨著Aurora-A的高表達(dá)產(chǎn)生對(duì)吉西他濱的耐藥（如PANC-1/R2細(xì)胞株），其表達(dá)與轉(zhuǎn)移率無關(guān)。Aurora-A在PANC-1/R2組高表達(dá)，同樣轉(zhuǎn)移率高于PANC-1組，這些提示Aurora-A的表達(dá)與胰腺癌吉西他濱耐藥及腫瘤轉(zhuǎn)移率有關(guān)，均提示高表達(dá)Aurora-A的胰腺癌預(yù)后差。

[1] Huynh A S,Abrahams D F,Torres M S,et al.Development of an orthotopic human pancreatic cancer xenograft modelusing ultrasound guided injection ofcells[J].PLoS One,2011,6(5):e20330.

[2] Menke C,Goncharov T,Qamar L,et al.TRAIL Receptor Signaling Regulation of Chemosensitivity In Vivo but Not In Vitro[J].PLoS One,2011,6(1):e14527.

[3] El-Sheikh A,Fan R,Birks D,et al.Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma CellLines[J].Pediatr Blood Cancer,2010,55:35-41.

[4] Kumano M,Miyake H,Terakawa T,et al.Suppressed tumour growth and enhanced chemosensitivity by RNA interference targeting Aurora-A in the PC3 human prostate cancer model[J].BJU Int,2010,106(1):121-127.

[5] Wang XX,Liu R,Jin S Q,et al.Overex pres sion ofAurora-Akinase promotes tumor cell proliferati on and inhibits apoptos is in esophagealsquamous cellcarcinoma cellline[J].CellRes,2006,16 (4):356-366.

[6] Tanaka E,Hashimoto Y,Ito T,et al.The clinical significance of Aurora-A/STK15/BTAK expression in human esophageal squamous cellcarcinoma[J].Clin Cancer Res,2005,11(5):1827-1834.

[7] Reznikoff C A,Belair C D,Yeager T R,et al.A molecular g enetic model of human bladder cancer pathogenesis[J].Semin Oncol, 1996,23(5):571-584.

[8] Borges K S,Castro-Gamero A M,Moreno D A,et al.Inhibition of Aurorakinases enhances chemosensitivity to temozolomide and causes radiosensitization in glioblastoma Cells[J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,138(3):405-414.

[9] Tanaka E,Hashimoto Y,Ito T,et al.The Suppression of Aurora-A/STK15/BTAKExpression Enhances Chemosensitivity to Docetaxel in Human Esophageal Squamous Cell Carcinoma[J].Clin Cancer Res,2007,13(4):1331-1340.

[10] El-Sheikh A,Fan R,Birks D,et al.Inhibition of Aurora Kinase A Enhances Chemosensitivity of Medulloblastoma Cell Lines[J]. Pediatr Blood Cancer,2010,55(1):35-41.

[11] Sakaku ra C,H agiw ara A,Yas uoka R,et al.Tumour-amplif iedbkinas eBTAK is amplified and overex pres sed in gast ric cancers with possible involvem ent in aneu ploid formation[J].Br J Cancer,2001,84(6):824-831.

[12] Warner S L,Mun oz R M,Stafford P,et al.Comparing Aurora-A and Aurora-B as molecul ar t arget s f or growth in hibit ion of pancreaticcancercells[J].MolCancerTher,2006,5(10):2450-2458.

[13] Zou Z,Yuan Z,Zhang Q,et al.Aurora kinase Ainhibition-induced autophagy triggers drug resistance in breast cancer cells[J]. Autophagy,2012,8(12):1798-1810.

[14] Hamidi T,Cano C E,Grasso D,et al.Nupr1-aurora kinase A pathway provides protection against metabolic stress-mediated autophagic-associated celldeath[J].ClinCancerRes,2012,18(19): 5234-5246.

（本文編輯：楊麗）

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本刊編輯部

Association between expression of Aurora-A and gemcitabine-resistance in pancreatic cancer cells

HE Yongli，SHI Futian，YAN Qiuliang，et al.Department of General Surgery，the Second Affiliated Hospital Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310009,China

Aurora-Akinase Pancreatic carcinoma Multiple drug resistance Gemcitabine

2014-07-09）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃（2012KYB018），浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金（2013ZQ021）

310009 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科（何永禮、朱錦輝，何永禮系在職研究生，現(xiàn)在金華文榮醫(yī)院普外科工作）；金華文榮醫(yī)院普外科（施福田），金華市人民醫(yī)院普外科（嚴(yán)秋亮）

朱錦輝，E-mail：steversson@126.com